Nous présentons un protocole pour l’extraction des péritéytes cérébraux murines. Basé sur une extraction de périyte orientée vers l’enrichissement sans antibiotiques, ce protocole est un outil précieux pour les études in vitro offrant une pureté élevée et un rendement élevé, diminuant ainsi le nombre d’animaux expérimentaux utilisés.
Ces dernières années, les péritéytes cérébraux sont devenus le centre de recherches approfondies en biologie vasculaire et en pathologie. L’importance des péritéytes dans la formation et la physiologie de barrière de cerveau-encéphalique est maintenant démontrée mais sa base moléculaire demeure largement inconnue. Comme le rôle pathophysiologique des péritéytes cérébraux dans les troubles neurologiques est intrigant et d’une grande importance, les modèles in vitro sont non seulement suffisamment appropriés, mais aussi en mesure d’intégrer différentes techniques pour ces études. Plusieurs méthodes ont été proposées comme modèles in vitro pour l’extraction des péricartes cérébraux, bien qu’un protocole sans antibiotiques avec un rendement élevé soit souhaitable. Plus important encore, une méthode qui a augmenté la production par extraction réduit l’utilisation de plus d’animaux.
Ici, nous proposons une méthode simple et efficace pour extraire les péricytes cérébraux avec une production suffisamment élevée. L’homogénéité du tissu cérébral de la souris est mélangée à une solution BSA-dextran pour la séparation des débris tissulaires et des granulés microvasculaires. Nous proposons une séparation en trois étapes suivie d’une filtration pour obtenir un filtrate riche en micronavires. Avec cette méthode, la quantité de fragments microvasculaires obtenus à partir de 10 souris est suffisante pour ensemencer 9 puits (9,6 cm2 chacun) d’une plaque de 6 puits. Plus intéressant avec ce protocole, l’utilisateur peut obtenir 27 puits riches en périytes (9,6 cm2 chacun) dans le passage 2. La pureté des cultures péririytes est confirmée par l’expression de marqueurs péritéytes classiques : NG2, PDGFR-et CD146. Cette méthode démontre un outil in vitro efficace et faisable pour les études physiologiques et pathophysiologiques sur les péritéytes.
Les péritéytes cérébraux sont un composant essentiel de l’unité neurovasculaire (NVU), qui comprend une unité fonctionnelle avec les cellules endothéliales cérébrales de la barrière hémato-encéphalique (BBB), des cellules gliales, de la matrice extracellulaire et des neurones. Les péricartétes sont une partie essentielle du fonctionnement réglementé du système nerveux central (SNC) car ils servent d’interfaces pour l’échange d’informations moléculaires et cellulaires.
Les péritéytes cérébraux sont incorporés dans le côté abluminal des microvaisseaux cérébraux, et sont essentiels pour établir1 et maintenir2 la physiologie de BBB. Plusieurs travaux récents ont également mis en évidence le rôle des péritéytes cérébraux dans l’angiogenèse3 et la maturation des vaisseaux4, morphogénèse endothéliale5 et la survie6, et dans le contrôle du métabolisme du cholestérol du cerveau7. Fait important, la dysrégulation dans l’un de ces processus sont des caractéristiques étiologiques des maladies neurodégénératives.
En effet, les périytes sont une nécessité fonctionnelle pour le fonctionnement normal de BBB et sa protection contre la progression de plusieurs maladies neurologiques. La physiologie dégénérative et la perte des péritéytes sont des dénominateurs communs dans la progression de la maladie d’Alzheimer8, perte neuronale pendant le dysfonctionnement de la matière blanche9, sclérose en plaques10, encéphalopathie septique11, phase aigue accident vasculaire cérébral ischémique12 et dans d’autres troubles neurologiques. Les péricartes sont également instrumentés dans la métaste tumorale13. Intéressant, les péritéytes ont également été montrés pour montrer un rôle de sauvetage après trauma et désordres neurologiques : dans la remyelination dans le cerveau1,course ischémique, dommages de moelle épinière14 et favorisant l’angiogenèse15. La susceptibilité des péricartes pour renforcer la manifestation pathophysiologique des traumatismes et des désordres neurologiques en fait une cible thérapeutique potentielle16.
Les modèles de recherche in vitro des périytes dans le BBB sont des outils importants pour mener des études approfondies. Ces modèles fournissent une plate-forme pour des études plus élaborées en représentant des modèles de travail de la BBB et plus encore. Par exemple, ces modèles peuvent être utilisés pour comprendre la physiologie cellulaire chez les péricytes et parmi d’autres types de cellules de la NVU. En outre, les modèles in vitro sont des outils d’investigation de première main pour tester l’influence pharmacologique de nouveaux médicaments et molécules sur les péritéytes. Ces modèles peuvent également être utilisés pour comprendre le rôle pathophysiologique des périticytes par rapport aux troubles neurologiques. Néanmoins, le développement de modèles in vitro nécessite une production accrue pour permettre la liberté expérimentale. Ces modèles doivent être faciles et rapides, et réduire le nombre d’animaux expérimentaux utilisés. En outre, la capacité de développer de tels modèles dans un modèle de culture à deux et triple cellules est souhaitable.
Il y a beaucoup de protocoles qui ont été développés. Les protocoles proposés par Tigges et coll.17, Chen et coll.18, Thomsen etal. 19, Yamazaki et coll.20, et Crouch et Doetsch21 sont des approches louables qui satisfont la plupart des nécessités. Toutes ces méthodes donnent des résultats efficaces, mais la dépendance à un grand nombre d’animaux expérimentaux reste un dénominateur commun pour ces protocoles. Par conséquent, il devient obligatoire de développer une méthode de sortie élevée qui peut isoler et purifier les périrites avec un maximum d’efficacité possible. Dans ce protocole, la pureté des cellules obtenues après un deuxième passage est vérifiée avec plusieurs marqueurs de péritéytes. Nous avons vérifié pour le récepteur de facteur de croissance dérivé de plaquettes (PDGFR- – ‘ ), qui est employé comme marqueur classique des péritéytes17,et pour NG2 (antigène neuron-glial 2), qui est un marqueur de la morphogenèse vasculaire médiée de périyte22 et de la vascularisation23. Nous avons également vérifié le cluster de différenciation 146 (CD 146), qui a été rapporté comme l’une des molécules exprimées dans les péritéytes17,18.
Ici, nous présentons un protocole pour l’extraction des péritytes primaires à partir de souris (type sauvage ou transgénique) qui satisfera toutes les exigences susmentionnées avec une production élevée. Nous employons une méthode de sélection libre d’antibiotiques et d’immunopanning pour les périytes cérébraux primaires, qui se révélera un modèle efficace pour mener des études in vitro.
Les péricartes cérébraux font partie intégrante de la NVU et jouent un rôle actif dans l’induction et l’entretien du BBB24. De même, le rôle de ces cellules dans les différents troubles neurodégénératifs et pathologies vasculaires est intrigant. Par conséquent, un modèle efficace de cellules péricytes primaires à haut rendement fournira une plate-forme efficace pour les études in vitro.
Divers protocoles ont été proposés pour l’isolement des péricarytes primaires (figure 4). Tigges et coll.17 ont suggéré une méthode comprenant le tissu cortical avec des méninges. Cette approche est la tendreisation des tissus de 6 souris (une digestion de 37 oC, 70 min avec des enzymes papaïnes/DNase) suivie d’une étape de désintégration via 21 G et 18 G aiguilles. Ce protocole suggère une séparation en une étape (centrifugation dans 22% BSA/PBS solution) qui donne au moins 2 collagène i enduit puits d’une plaque de 6 puits. Les cellules sont maintenues dans le milieu de croissance de cellules endothéliales (ECGM) jusqu’au passage 3 et plus tard dans le milieu de croissance de périyte (PGM) pour des cellules de passage pour favoriser la prolifération de périyte. Dans une autre approche similaire, Chen et coll.18 ont proposé la dissociation des tissus en coupant le tissu en dés avec une lame de rasoir stérilisée et une digestion des tissus avec de la collagène/DNase pendant 90 min à 37 oC. Après une séparation en une seule étape (centrifugation dans 22% BSA) des cellules, la couche de myéline est enlevée et la pastille est lavée deux fois dans ECGM. Les micronavires sont plaqués dans 3 puits d’un collagène que j’ai enduit 6 plaques de puits. Après avoir atteint la confluence, les cellules sont passages deux fois et plus tard maintenus dans PGM. En fin de compte, si les cellules sont passées en rapport de 3, nous pouvons obtenir 27 puits de plaques de 6 puits seulement à l’utilisation de 10 souris au début du protocole.
Dans Thomsen et autres, les auteurs suggèrent l’isolement des péricartétes cérébraux par l’intermédiaire d’une digestion en deux étapes d’enzyme19. Les méninges et la matière blanche sont enlevés, et les échantillons de cerveau sont coupés en petits morceaux. Les morceaux de tissu subissent la première réaction enzymatique dans la collagène/DNase I pendant 75 min à 37 oC, après une étape de séparation dans 20% BSA. La pastille est recueillie et digérée en collagène/dispase/DNase I pendant 50 min à 37 oC. Cette étape est suivie d’une séparation micronavire dans un gradient Percoll de 33 % et lavée une fois de plus. Les micronavires sont ensebiens sur du collagène IV/fibronectin enduit de vaisselle de 35 mm. La prolifération des péritéytes est favorisée par 10% FCS et sulfate de gentamicine dans DMEM pendant 10 jours. Dans une autre approche de digestion en deux étapes d’enzyme, Yamazaki et autres suggèrent de mincing du tissu excisé dans le DMEM froid20. Dans la première réaction enzymatique, les échantillons sont traités avec de la collagène/DNase I pendant 75 min à 37 oC. Après une centrifugation d’étape, le granule est à nouveau lavé une fois et une deuxième réaction enzymatique est lancée dans la collagène/dispase pendant 60 min à 37 oC. Après une séparation en une seule étape, le granule est suspendu et centrifugé dans une solution BSA de 22 %. Enfin, le granule microvasculaire est resuspendu et plaqué dans une plaque de 6 puits. Pour 5 cerveaux de souris, 1 puits d’une plaque de 6 puits peut être plaqué. Pour obtenir les péricytes, les cultures endothéliales sont passages trois fois tandis que maintenus dans la cellule endothéliale de cerveau de souris (mBEC) moyen II. Crouch et Doetsch20 suggèrent la méthode de purification de périyte par FACS. Les échantillons de tissus du cortex et de la zone ventriculaire-sous-ventriculaire du cerveau de souris sont micro-disséqués et hachés à fond avec un scalpel. Après l’incubation de l’enzyme collagène/dispase pendant 30 min à 37 oC, le tissu digéré est séparé de la myéline et des débris centrifuges dans une solution Percoll de 22 % v/v. La suspension cellulaire est ensuite incubée dans des anticorps conjugués fluorescents pour l’analyse et le tri FACS. Les cellules triées sont plaquées dans des puits enduits de collagène de 24 plaques de puits. Il est suggéré qu’un cortex donne assez de cellules pour un placage dans 1 puits de la plaque de 24 puits.
Même si elles sont productives, ces méthodes sont assorties de plusieurs limitations, allant de l’utilisation d’un nombre élevé d’animaux pour l’isolement par lots unique à une quantité très limitée de production.
Au cours de l’élaboration de ce protocole proposé, nous avons réussi à obtenir un rendement élevé : 9 puits d’une plaque de 6 puits d’aussi peu que 10 souris. À cette fin, l’enlèvement des méninges assure l’enlèvement d’une étape des grands vaisseaux du tissu. Le broyeur de tissu Dounce est plus approprié pour les tissus mous tels que le cerveau. Il assure également la réduction de l’échantillon avec le pilon lâche, l’homogénéisation avec le pilon serré, et empêche les dommages cellulaires inutiles. L’un des principaux objectifs dans les protocoles de culture cellulaire primaire est le gaspillage minimal de tissu et la récupération prolongée de la vascularisation cérébrale. Dans le protocole présenté, ceci est réalisé par la centrifugation répétitive de l’homogénéisé infusé de tissu dextran-BSA. Une approche de centrifugation en trois étapes aide à récupérer de grandes quantités de vascularisation du tissu homogénéisé. Cela fournit une récupération 3x améliorée des micronavires. Après la séparation, la filtration est la prochaine étape essentielle, qui favorise l’exclusion des grands vaisseaux associés aux cellules musculaires lisses. Comme mentionné précédemment une combinaison de différentes enzymes a été proposée pour la digestion enzymatique. Tandis que le DNase et le collagène/dispase sont employés pour réduire des amas de cellules et isoler des cellules simples respectivement, il est très important de prévenir la mort cellulaire dans un tel environnement invasif et ceci est empêché par TLCK, qui augmente de ce fait le rendement final. Initialement, le premier passage est autorisé à cultiver une monocouche endothéliale, qui soutient plus tard la croissance des péritéytes attachés sur l’unicouche. Puisque la survie des cellules endothéliales primaires est réduite au passage, elle augmente la probabilité pour la récupération de péritéyte. En outre, ce protocole utilise un autre passaging qui assure l’évitement de la contamination des cellules endothéliales. Il convient de noter qu’avec un plus grand nombre de cellules de P2, la dépendance à la poursuite de la passaging des cellules est réduite. En outre, il réduit la possibilité de croissance du périyte étant dépassé par les cellules musculaires lisses, qui prolifèrent sur un taux beaucoup plus élevé.
Afin d’obtenir une production plus élevée, il y a plusieurs étapes qui sont critiques et doivent être exécutées avec précision en ce qui concerne la température et le temps. Le mélange des tissus homogénéisés en BSA-dextran devrait être rapide. La dissociation des granulés après les étapes de centrifugation doit être rapide pour prévenir la mort cellulaire. En outre, 33 min de digestion enzymatique doit être fait avec précision et soin. Une des limitations de ce protocole est la durée de 7-8 jours que l’unicouche endothéliale est autorisé à se développer et à faciliter davantage la croissance des périrites. De toute évidence, l’isolement des micronavires est btter, la croissance de l’unicouche est plus rapide, et donc il ya un nombre accru de périticytes. Il est recommandé de ne pas utiliser moins de 10 souris dans chaque extraction pour assurer un nombre suffisant de fractions microvasculaires pour soutenir la croissance du périyte. Si les points mentionnés ci-dessus sont suivis avec soin, la densité cellulaire désirée pour la culture cérébrale de périyte peut être facilement réalisée.
Les modèles in vitro fournissent une plate-forme réalisable pour le développement de modèles dérivés pour obtenir plus d’informations sur la pertinence pathophysiologique et la communication entre les autres cellules de la NVU pendant les troubles neurologiques. Les péritéytes isolés peuvent être incorporés dans une culture bicellulaire (avec des cellules endothéliales ou gliales) et tricellulaires (cellules endothéliales et gliales). L’élaboration de ces modèles n’a pas été discutée ici. Pour conclure, ce protocole fournit une approche pour l’isolement des cellules primaires avec un rendement plus élevé et une meilleure plate-forme pour la recherche in vitro liée à la biologie du périyte cérébral.
The authors have nothing to disclose.
LT et FG ont été accordés par l’Agence Nationale de la Recherche (ANR, ANR-15-JPWG-0010) dans le cadre du programme conjoint de l’UE – Neurodegenerative Disease Research (JPND) pour le projet SNOWBALL.
Amino acids BME | Sigma | B-6766 | Store at 4 °C. |
Basal DMEM media | Invitrogen | 316000083 | Store at 4 °C. |
Basic fibroblast growth factor | Sigma | F-0291 | Store at -20 °C. |
BSA | Sigma | A-8412 | Store at 4 °C. |
Collagenase dispase | Sigma | 10269638001 | Prepare a 10x stock solution in sterile PBS-CMF. Filter the solution with a 0.22 μm syringe filter and store at -20 °C. Note: For the enzyme digestion step of the protocol, for every set of 10 mice for extraction, 300 µL of 10x collagenase dispase is required. |
Dextran | Sigma | 31398 | |
DNase I | Sigma | 11284932001 | Prepare a 1000X stock solution by dissolving 100 mg in 10 ml sterile water and store at -20°C. |
Gelatin | Sigma | G-2500 | Prepare the working coating by making a 0.2% gelatin solution in sterile PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 0.2 g/L KH2PO4, 2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). Autoclave the solution for minimum 20 minutes at 120 °C and store at room temperature. Culture dishes to be coated for at least 4 hours at 4 °C. |
Gentamycin | Biochrom AG | A-2712 | Store at 4 °C. |
Glutamine | Merck | I.00289 | Store at -20 °C. |
HBSS | Sigma | H-8264 | Store at 4 °C. |
HEPES | Sigma | H-0887 | Store at 4 °C. |
Matrigel | BD Biocoat | 354230 | Prepare a working coating solution of Matrigel by diluting stock in cold DMEM at 1:48 ratio with its final concentration to be 85 µg/cm2. Cell culture dishes should be coated at least for 1 hour at room temperature. |
Pericyte Medium-mouse | Sciencell research laboratories | 1231 | Store at 4 °C. |
Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone | Sigma | T-7254 | Prepare a 1000X stock solution in WBA by dissolving 16 mg in 10.88 mL of WBA to make a 4 mM solution and store at 4 °C. |
Vitamins | Sigma | B-6891 | Store at -20 °C. |
Equipment Requirements | |||
Filtration tools | Sefar, Nylon mesh, 60-micron porosity | ||
Laboratory equipment | Swing bucket rotor centrifuge | ||
Water bath with agitator | |||
Laminar Flow Hood : BSL2 | |||
Glassware (all components to be heat sterilized) | Dounce Tissue Grinder With Glass Pestle | ||
Pestle I: 0.0035 – 0.0065 inches | |||
Pestle II: 0.0010 – 0.0030 inches | |||
Vacuum filter assembly with coarse porosity fritted glass filter support base | |||
Surgical dissection tools (all components to be heat sterilized) | Forceps, scissors, Bunsen burner, cotton swabs, gauge |