Separazione dell'involucro cellulare per i batteri Gram-negativi in frazioni di membrana interne ed esterne con regolazioni tecniche per Acinetobacter baumannii

I batteri Gram-negativi producono due membrane separate da uno spazio periplasmico e da una parete cellulare peptidoglycan¹. La membrana interna (IM) racchiude il citosol ed è un bistrato simmetrico di fosfolipidi. Peptidoglycan protegge dalla pressione del turgor e fornisce al batterio una forma cellulare, ed è attaccato alla membrana esterna (OM) da lipoproteine^2,3. L’OM circonda il periplasma ed è prevalentemente asimmetrico. Il volantino interno è costituito da fosfolipidi e il volantino esterno è costituito da glicolipidi noti come lipooligosaccori (LOS) o lipopoliosaccori (LPS)^4,5. L’asimmetria lipidica e la biochimica delle molecole LOS/LPS nel foglio esterno conferiscono proprietà di barriera alla superficie cellulare che proteggono il batterio dai pericoli nel suo ambiente^6,7.

Le molecole LPS sono costituite da tre costituenti: il lipido A disaccharolipid, l’oligosaccharide del nucleo e l’O-polysaccharide o O-antigen. Il lipid A è un disaccatipio moltiplicato. Core-oligosaccharides sono costituiti da 10-15 zuccheri noti come LPS grezzi o R-LPS. Il nucleo è suddiviso nella regione interna, composta da 2-keto-3-deossiosa-D-manno-octuloniciati (kdo) e uno o più residui di eptosi, e una regione esterna che consiste generalmente di esrossi (glucosio o galactose) ed eptosi, o zuccheri di acetamido^{5 .} L’area del nucleo esterno è più variabile nei suoi componenti e struttura rispetto al nucleo interno. In Salmonella spp., è stata descritta solo una struttura centrale; tuttavia, in Escherichia coli ci sono cinque diverse strutture centrali (designato K-12, R1, R2, R3 e R4)⁸. E. coli K-12 DH5, che usiamo in questa procedura porta una mutazione che si traduce nella produzione di R-LPS⁹. Le molecole R-LPS non hanno la moiety O-antigene e hanno un peso molecolare simile alle molecole LOS.

L’aggiunta di O-antigen a R-LPS trasforma questa molecola in LPS lisci, o S-LPS. Gli antigeni O sono costruiti da brevi sottounità di carboidrati 3-4 e consistono in molteplici modalità con diverse lunghezze di catena¹⁰. Alcuni batteri che producono LPS, come la Salmonella enterica siriburia Typhimurium (S. Typhimurium), visualizzare una distribuzione trimodale di molecole LPS sulla loro superficie^10,11. Gli antigeni O-antigeni a catena molto lunga possono contenere oltre cento sottounità e pesare oltre cento chilodaltoni. Gli antigeni O forniscono proprietà superficiali al batterio che sono necessarie per resistere agli antibiotici, eludere la predazione da batteriofagi e causare malattie.

Specie di Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria e altri generano molecole LOS invece di molecole LPS sulla loro superficie¹². Le molecole LOS sono costituite da oligosaccaridi lipidi e core, ma non hanno l’antigene O. Questi tipi di batteri Gram-negativi modificano le loro oligosaccoridi del nucleo con zuccheri aggiuntivi e combinazioni di zuccheri per alterare le proprietà della superficie¹². Sia i microbi che loS e i microbi che producono LPS derivano i fosfati sul lipido A e sulle molecole centrali con moieties cationiche⁷. Queste aggiunte includono fosfoetanolamina, galactosamine e sostituti aminoarabinosi, che funzionano neutralizzando la carica superficiale anionica e proteggendo così contro i peptidi antimicrobici cationici. I batteri Gram-negativi modificano anche la struttura del nucleo dell’oligosaccoride con sostituzioni variabili non stoichiometriche di zuccheri, o molecole extra kdo, e alterano il numero di catene di acili su lipid-A disaccharolipids⁷.

La capacità di isolare l’IM dall’OM dei batteri Gram-negativi è stata fondamentale per comprendere il ruolo dell’involucro cellulare nella resistenza antimicrobica e nella patogenesi della malattia^11,12. Le derivazioni di questo approccio sono state utilizzate per dedurre i meccanismi di assemblaggio, manutenzione e rimodellamento della proteina, del fosfolipido e dei costituenti glicolipidi per l’OM.

Il nostro laboratorio esegue regolarmente analisi lipidomiche batteriche per studiare la regolazione dei lipidi mediati da proteine e la funzione lipidica in una varietà di specie Gram-negative. I volumi utilizzati nel protocollo riflettono l’uso di routine di questa procedura per analizzare fosfolipidi non etichettati con etichettatura non radiografica mediante cromatografia a strati sottili e spettrometria di massa tandem di cromato liquida^13,14.

Il protocollo inizia esponendo una sospensione refrigerata di batteri Gram-negativi a una soluzione ad alta osmolare di saccarosio e aggiungendo lysozyme per dissociare l’OM dallo strato peptidoglycan sottostante (Figura 1)¹². L’EDTA viene quindi aggiunto per facilitare la penetrazione del liso, poiché il sequestro della cation divalente interrompe le interazioni di bridging elettrostatico laterale tra molecole LOS/LPS adiacenti¹⁵. Il protocollo originale da cui è stato adattato il nostro richiedeva la formazione di sferoplasti, una forma di cellule batteriche Gram-negative che consistono in una membrana plasmatica e un citosol, ma manca dello strato peptidoglycan e di un OM. È possibile che gli sferoplasts siano prodotti con il metodo adattato; tuttavia, la tecnica non si basa o intende sulla loro formazione per il successo. Invece, i batteri trattati lysozyme-EDTA vengono rapidamente raccolti dalla centrifugazione e ri-sospesi in una soluzione di saccarosio di minore concentrazione prima della lissi pressurizzata. Le OM che potrebbero essere state rilasciate formando sferoplasti dovrebbero in teoria essere raccoglibili dai supernatanti delle cellule trattate, ma questo approccio non è dettagliato nel presente documento. In definitiva, le cellule trattate sono sottoposte a omogeneizzazione e lisi convenzionale, che migliora l’efficienza e la riproducibilità della procedura di separazione della membrana¹⁶.

Dopo la lisi, le membrane totali vengono raccolte per ultracentrifugazione e applicate a un gradiente di densità di discontinuo di saccarosio per frazionare gli IM e gli OM. L’approccio classico utilizza un gradiente più continuo costituito da almeno cinque diverse soluzioni di saccarosio^11,12. Il gradiente discontinuo nel nostro protocollo è costituito da tre soluzioni di saccarosio e divide i bistrati in due frazioni distinte¹⁷. Le molecole LOS e LPS all’interno delle OM dei batteri Gram-negativi spingono l’involucro a dividersi in una frazione IM a bassa densità marrone superiore e in una frazione OM bianca ad alta densità inferiore(Figura 1 e Figura 2).

Acinetobacter baumannii sono importanti patogeni umani multifarmacoresistenti che producono molecole LOS nel loro OM ed erigono un involucro cellulare che è difficile separare^18,19. Recenti lavori suggeriscono che una derivazione del protocollo che presentiamo qui può essere utilizzata per dividere i bistrati di questi organismi²⁰. Pertanto, abbiamo testato il nostro protocollo su A. baumannii 17978. Inizialmente, la procedura era inadeguata. Tuttavia, abbiamo modificato la concentrazione di saccarosio della soluzione a densità media e migliorato notevolmente la separazione (Figura 2). È stato utilizzato un assaggio di disidrogeno NADH e una procedura di estrazione e rilevazione LOS/LPS per confermare la separazione per A. baumannii, di tipo selvaggio S. Typhimurium e due genotipi enterobatterici carenti di O-antigene; vale a dire, galE-mutant S. Typhimurium e un ceppo di laboratorio, E. coli DH5 (Figura 3 e Figura 4).

L’intento di questo lavoro è quello di fornire un approccio semplificato per isolare riproducibilmente le membrane dei batteri Gram-negativi. Il protocollo può essere utilizzato per studiare molti tipi di molecole associate alla membrana per questi microbi.