アシネトバクターバウマンニの技術的調整によるグラム陰性細菌の細胞エンベロープの内膜および外膜分画への分離

グラム陰性菌は、周膜空間とペプチドグリカン細胞壁¹によって分離された2つの膜を産生する。内膜(IM)は、細胞質ゾルを包み込み、リン脂質の対称的な二重層である。ペプチドグリカンは、ターゴール圧から保護し、細胞形状を有する細菌を提供し、そしてリポタンパク質^22、33によって外膜(OM)に付着している。OM は周辺を取り囲み、主に非対称です。内側のリーフレットはリン脂質から成り、外葉はリプーリゴ糖(LOS)またはリポ多糖類(LPS)4,5として知られる糖脂質からなる。^4,5外リーフレット中のLOS/LPS分子の脂質非対称性および生化学は、その環境における危険から細菌を保護する細胞表面に対するバリア性を与^{える66,7。}

LPS分子は、脂質A二糖脂質、コアオリゴ糖、およびO-多糖類またはO抗原の3つの構成成分で構成されています。脂質Aは、増殖アシル化二糖分脂質である。コアオリゴ糖は、ラフLPSまたはR-LPSとして知られている10〜15の糖で構成されています。コアは、内領域に細分化され、2-ケト-3-デオキシ-D-マンノ-オクチュロソニック酸(kdo)および1つ以上のヘプトーゼ残基と、ヘキソス(グルコースまたはガラクトース)およびヘプトーゼ、またはアセタミド糖からなる外側領域^から構成される。外側のコア領域は、内部コアよりもコンポーネントと構造の中で変数が多くなります。サルモネラ属のspp.では、1つのコア構造のみが記載されている。しかし、大腸菌には5つの異なるコア構造(K-12、R1、R2、R3、およびR4)^{があります。}大腸菌K-12 DH5αは、この手順で使用し、生産R-LPS⁹をもたらす突然変異を運ぶ。R-LPS分子はO抗原部分を欠き、LOS分子と同様の分子量を有する。

R-LPSにO抗原を加えて、この分子は滑らかなLPS、またはS-LPSに変わります。O抗原は短い3-4炭水化物サブユニットから構築され、様々な鎖の長さを持つ複数のモダリティで構成されています¹⁰.いくつかの LPS 産生細菌,サルモネラ腸内細菌セロバー ティフィムリウム (S.チフィムリウム)は、その表面^10,11にLPS分子の三様分布^を11表示する。非常に長い鎖O-抗原は100個以上のサブユニットを含み、100キロダルトン以上の重量を量ることができる。O抗原は、抗生物質に抵抗し、バクテリオファージによる食前を回避し、病気を引き起こすのに必要な細菌に表面特性を提供する。

カンピロバクターの種は、ボルデテラ、アシネトバクター、ヘモフィルス、ネイセリア等が、その表面¹²にLPS分子の代わりにLOS分子を生成する。LOS分子は、脂質Aとコアオリゴ糖で構成されていますが、O抗原は欠いています。グラム陰性細菌のこれらのタイプは、表面特性を変更するために、追加の糖と糖の組み合わせでそれらのコアオリゴ糖を変更します¹².LOSとLPS産生微生物の両方が、カチオン部分⁷で脂質Aとコア分子のリン酸塩を誘導体化する。これらの添加物には、ホスホエタノールアミン、ガラクトサミンおよびアミノアラビノース置換が含まれ、アニオン性表面電荷を中和し、それによってカチオン性抗菌ペプチドから保護することによって機能する。グラム陰性細菌はまた、糖の可変的な非ストキシオメトリック置換、または余分なkdo分子を用いてコアオリゴ糖構造を修飾し、脂質A二糖鎖にアシル鎖の数を変える^7。

グラム陰性細菌のOMからIMを単離する能力は、抗菌性および疾患病態の病態の細胞エンベロープの役割を理解するのに役立った^11,12。11,このアプローチの導出は、OMのタンパク質、リン脂質、および糖脂質成分の組み立て、維持、およびリモデリングのメカニズムを推測するために使用されてきました。

当社の研究室では、細菌性リピドミック解析を日常的に行い、様々なグラム陰性種におけるタンパク質媒介脂質調節と脂質機能を研究しています。プロトコルで使用される体積は、薄層クロマトグラフィーおよび液体クロマトグラフィータンデム質量分析^13,14による非放射性標識リン脂質を分析するためのこの手順の日常的な使用を反映^{13している}。

このプロトコルは、グラム陰性細菌の冷やされた懸濁液をスクロースの高い浸透膜溶液に曝露し、基底のペプチドグリカン層からOMを解離するためにリソザイムを加えることによって始まる(図1)^12。EDTAは、次いでリゾチームの浸透を促進するために添加され、二価カチオンの隔離は隣接するLOS/LPS分子¹⁵間の横静電橋合動を破壊するので。私たちの適応された元のプロトコルは、球形膜とサイトゾルで構成されるグラム陰性細菌細胞形態である球体の形成を必要としましたが、ペプチドグリカン層とOMを欠いています。球状体は適合した方法で作り出される可能性があります。しかし、この技術は成功のために彼らの形成に依存したり、意図していません。代わりに、リソチームEDTA処理細菌は遠心分離によって急速に収穫され、加圧溶解の前にスクロース溶液中でより少ない濃度で再懸濁される。球形突体を形成して放出された可能性のあるOEMは、理論的には、処理された細胞の上清から収穫可能であるべきであるが、このアプローチは本明細書では詳述されていない。最終的に、処理された細胞は、従来の均質化および溶解に供され、膜分離手順¹⁶の効率および再現性を高める。

リシスの後、全膜は超遠心分離によって収集され、不連続なスクロース密度勾配に適用され、DMおよびOEMを分画する。古典的なアプローチは、少なくとも5つの異なるショ糖溶液^11、12,12で構成される、より連続的なグラデーションを使用します。プロトコルの不連続勾配は、3つのスクロース溶液で構成され、二重層を2つの異なる分数¹⁷に分割します。グラム陰性細菌のOEM内のLOSおよびLPS分子は、エンベロープを駆動して上部茶色の低密度IM画分と下白高密度OM分率に分割する(図1および図2)。

アシネトバクターバウマンニーは、そのOMでLOS分子を産生し^{、18、19,19}を分離することが困難である細胞エンベロープを建てる重要な多剤耐性ヒト病原体である。最近の研究は、我々がここで提示するプロトコルの派生は、これらの生物²⁰の二重層を分割するために使用することができることを示唆している。したがって、我々はA.バウマンニ17978で私たちのプロトコルをテストしました。当初、手順は不十分でした。しかし、中密度溶液のスクロース濃度を大幅に改善し、分離を大幅に改善した(図2)。NADHデヒドロゲナーゼアッセイとLOS/LPS抽出および検出手順を使用して、野生型SであるA.バウマンニの分離を確認した。腸炎と2つのO抗原欠損腸菌遺伝子型;すなわち、galE-変異体S.腸炎と実験室株,大腸菌DH5α(図3および図4)。

この研究の目的は、グラム陰性細菌の膜を再現的に単離するための合理化されたアプローチを提供することです。プロトコルは、これらの微生物のための膜関連分子の多くのタイプを研究するために使用することができます。