הפרדת מעטפת התא עבור חיידקים גראם שליליים לתוך שברים פנימיים וחיצוניים ממברנה עם כוונונים טכניים עבור בעלי הביטוח העצמי

חיידקים גראם שליליים לייצר שתי ממברנות כי הם מופרדים על ידי החלל הפריפלזמית והתא התאים פפטידוגליקן¹. הממברנה הפנימית (IM) מנתיקים את הציטוזול והוא מהווה בינה סימטרית של פוספוליפידים. Peptidoglycan יכול להגן מפני לחץ טורגור ומספק את החיידק עם צורה תא, והוא מחובר הקרום החיצוני (אום) על ידי ליפופרוטאינים^2,3. ה-OM מקיף את הפריפלמטר והוא ברובו אסימטרית. העלון הפנימי מורכב מפוספוליפידים והעלעל החיצוני כולל גליקולפידים המוכרים כ-lipooligosaccharides (LOS) או ליפופוליסכדים (lps)^4,5. א-סימטריה השומנים וביוכימיה של מולקולות לוס/lps בעלון החיצוני מעניקים למאפייני המכשול את משטח התא המגן על החיידק מפני סכנות בסביבתו^6,7.

מולקולות LPS מורכבות משלושה מרכיבים: ליפיד disaccharolipid, oligosaccharide הליבה, ואת O-רב-סוכר או O-אנטיגן. ליפיד A הוא disaccharolipid מכפלה. Core-oligosaccharides מורכב 10 – 15 סוכרים המכונה LPS מחוספס או R-LPS. הליבה מחולקת לתוך האזור הפנימי, המורכב מ-2-כתו-3-דיקסי-D-מאנאין-אובלי-אוטוסוניק (kdo) ואחד או יותר שאריות הפיז, ואזור חיצוני המורכב בדרך כלל מהקאוסס (גלוקוז או גלקטוז) והפטטוסים, או מרחמת סוכרים⁵. אזור הגרעין החיצוני משתנה יותר ברכיביו ובמבנה מאשר הליבה הפנימית. ב סלמונלה spp., רק מבנה אחד ליבה תוארה; עם זאת, ב Esהכלאיים coli יש חמישה מבני ליבה שונים (מיועד K-12, R1, R2, R3, ו-4)⁸. E. coli K-12 DH5α, שבו אנו משתמשים בהליך זה נושאת מוטציה שתוצאתה הייצור R-lps⁹. מולקולות R-LPS חסר הmoiety או אנטיגן ויש להם משקל מולקולרי דומה למולקולות LOS.

התוספת של O-אנטיגן ל-R-LPS הופך את המולקולה הזאת לחלקה LPS, או S-LPS. O-אנטיגנים בנויים קצר 3-4 שדות פחמימות משנה ומורכב של מספר מיטות עם אורכי שרשרת משתנים¹⁰. חיידקים מניבים מסוימים, כמו סלמונלה בידור בשיטת “היימוופיום” (S. Typhimurium), להציג התפלגות תלת מודאלית של מולקולות LPS על פני השטח שלהם^10,11. מאוד ארוך שרשרת O-אנטיגנים יכולים להכיל מעל 100 יחידות משנה ושוקלים מעל 100 kilodaltons. O-אנטיגנים לספק תכונות פני השטח לחיידק כי הם נחוצים כדי להתנגד לאנטיביוטיקה, להתחמק מראש על ידי בקטריה, ולגרום למחלות.

מינים של קמפילובקטר, בורידילה, acineטבק, האמפילוס, NEISSERIA ואחרים לייצר מולקולות לוס במקום lps מולקולות על פני השטח שלהם¹². מולקולות לוס מורכב ליפיד A ו oligosaccharides ליבה אבל חסר O-אנטיגן. סוגים אלה של חיידקים גראם שליליים לשנות את oligosaccharides הליבה שלהם עם סוכרים נוספים ושילובים של סוכרים כדי לשנות את השטח נכסים¹². הן לוס ו-LPS הפקת חיידקים ללעג פוספטים על השומנים A ואת הליבה מולקולות עם moieties^7ic. התוספות הללו כוללות פוספואנטואנאמין, גלטוסאמין והחלפות עמינח arabinose, אשר מתפקדים על ידי החלפת משטח הקרקע בנטרול ובכך הגנה מפני פפטידים מיקרוביאלית. חיידקים גראם שליליים גם לשנות את מבנה oligosaccharide הליבה עם משתנה שאינו stoichiometric החלפות של סוכרים, או מולקולות kdo נוספות, ולשנות את מספר שרשראות acyl על ליפיד-A disaccharolipids⁷.

היכולת לבודד IM מן האום של חיידקים גראם שליליים כבר אינסטרומנטלי להבנת התפקיד של מעטפת התא בהתנגדות מיקרוביאלית המחלה פתוגנזה^11,12. בגישה זו נעשה שימוש כדי להסיק מנגנונים של הרכבה, תחזוקה, ושיפוץ של חלבון, פוספוליפיד, ו גליקולפיד המרכיבים עבור האום.

המעבדה שלנו באופן שגרתי מבצעת ניתוחים lipidomic חיידקיים ללמוד חלבון בתיווך השומנים רגולציה ותפקוד השומנים במגוון של מינים גראם שליליים. אמצעי האחסון הנמצאים בשימוש בפרוטוקול משקפים את השימוש השגרתי בהליך זה כדי לנתח פוספוליפידים בעלי שכבה שאינה רדיוגרפית באמצעות¹³כרומטוגרפיה של שכבות דקות וכרומטוגרפיה כרומטוגרפית מאסיבית^{מסוג 13,14}.

הפרוטוקול מתחיל על ידי חשיפת השעיית מקורר של חיידקים גראם שליליים לפתרון אוסמוטי גבוה של סוכרוז והוספת ליזוזים לנתק את האום מן השכבה הבסיסית של פפטידוגליקן (איור 1)¹². EDTA לאחר מכן מתווסף כדי להקל על החדירה של lysozyme, מאז קיבוע על הקטיון משבש את האינטראקציות לרוחב אלקטרוסטטי גישור בין מולקולות LOS/LPS סמוכים¹⁵. הפרוטוקול המקורי שממנו שלנו הותאם נדרש היווצרות של כדורית, הטופס החיידק גרם-שלילי המכיל קרום פלזמה ו ציטוסול, אבל חסר את השכבה הפטיפדואפשר ואום. ייתכן כי הספרופור מיוצרים על ידי השיטה המותאמת; עם זאת, הטכניקה אינה מסתמכת או מתכוונת על היווצרות שלהם להצלחה. במקום זאת, החיידק lysozyme-EDTA מטופלים הם שנקטפו במהירות על ידי צנטריפוגה ומושעה מחדש בפתרון סוכות של ריכוז פחותה לפני הליזה בלחץ. OMs כי יכול להיות שוחרר על ידי יצירת ספרונטקיים צריך בתאוריה להיות harvestable מן הסופרנטנים של התאים התייחסו, אבל גישה זו לא מפורטת במסמך זה. בסופו של דבר, התאים התייחסו חשופים לטיפול הומוגון קונבנציונאלי, המשפר את היעילות והתוכקות של הליך הפרדת הממברנה¹⁶.

לאחר הליזה, הקרומים הכולל נאספים על ידי מעבר הדרגתי ומוחלים על צפיפות מתמשכת בדחיסות האנגיופלסטיקה של ה-IMs ו-OMs. הגישה הקלאסית משתמשת בדרגה רציפה יותר, המורכבת מחמישה^{מתוך חמש פתרונות}שונים של סוכות^,12. מעבר הדרגתי בפרוטוקול שלנו מורכב משלושה פתרונות של סוכות ומחיצות הבילאיירס לשני שברים נפרדים¹⁷. LOS ו-LPS מולקולות בתוך OMs של חיידקים גראם שליליים כונן את המעטפה למחיצה לתוך חום גבוה בצפיפות נמוכה IM שבר ושבריר נמוכה לבן נמוך בצפיפות גבוהה (איור 1 איור 2).

הביטוח העצמי של acineטבק הם גורמי האדם העמידים בפני תרופות רב-תרופתיים המייצרים לוס מולקולות באום שלהם והקמת מעטפת תא קשה להפריד^18,19. העבודה האחרונה עולה כי הנגזרת של הפרוטוקול שאנו מציגים כאן ניתן להשתמש כדי לחלק את הבילאיירס של אורגניזמים אלה²⁰. לכן, בדקנו את הפרוטוקול שלנו . בבית הביטוח העצמי 17978 בתחילה, ההליך היה מספיק. עם זאת, אנו שינו את ריכוז הסוכות של פתרון הצפיפות האמצעית ושיפור משמעותי בהפרדה (איור 2). השימוש בשיטת NADH דהידרוגנאז ובתהליך החילוץ והגילוי של לוס-אנג’לס שימש לאישור הפרדה של בעלי הבית, מסוגפראי . Typhimurium ושני מסוג O-אנטיגן לקויה הגנותיים; כלומר, מוטציה של גייל. Typhimurium ומאמץ מעבדה, E. coli DH5α (איור 3 ואיור 4).

כוונת העבודה הזאת היא לספק גישה מפושטת לבידוד הקרומים של חיידקים גראם שליליים. הפרוטוקול ניתן להשתמש כדי ללמוד סוגים רבים של מולקולות הקשורות לקרום עבור חיידקים אלה.