पूरे माउंट में सीटू संकरण में जेब्राफिश भ्रूण और ट्यूब गठन परख में iPSC-ECs में परख संवहनी विकास में एंडोग्लिन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए
Summary
यहां प्रस्तुत संवहनी गठन में एंडोग्लिन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए रोगी-व्युत्पन्न प्रेरित प्लूरिटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं में जेब्राफिश और ट्यूब गठन परख में सीटू आरएनए संकरण विश्लेषण में पूरे माउंट के लिए एक प्रोटोकॉल है।
Abstract
संवहनी विकास विशिष्ट जीन की अनुक्रमिक अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित किया जाता है, जिसका विभिन्न विकासात्मक चरणों के दौरान जेब्राफिश में सीटू संकरण परख में प्रदर्शन करके अध्ययन किया जा सकता है। वंशानुगत रक्तस्रावी टेलांगिया (एचएचटी) के विकास के दौरान पोत गठन में एंडोग्लिन (इंग्लैंड) की भूमिका की जांच करने के लिए, जेब्राफिश में एंजी के मॉर्फोलिन-मध्यस्थता लक्षित नॉकडाउन का उपयोग इसकी लौकिक अभिव्यक्ति और संबद्ध कार्यों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। यहां, सीटू आरएनए संकरण (इच्छा) में पूरे माउंट को ज़ेब्राफिश भ्रूण में इंग्लैंड और उसके डाउनस्ट्रीम जीन के विश्लेषण के लिए नियोजित किया जाता है। इसके अलावा, एचएचटी रोगी-व्युत्पन्न प्रेरित प्लीरिटेंट स्टेम सेल-विभेदित एंडोथेलियल कोशिकाओं (आईपीएससी-ईसी; इंग्लैंड म्यूटेशन के साथ) में ट्यूब गठन परख ें की जाती हैं। सीटू संकरण में पूरी राशि का उपयोग करके एक विशिष्ट सिग्नल एम्पलिंग सिस्टम – इच्छा पारंपरिक तरीकों की तुलना में उच्च संकल्प और कम पृष्ठभूमि परिणाम प्रदान करती है। बेहतर संकेत प्राप्त करने के लिए, निर्धारण के बाद का समय जांच संकरण के बाद 30 min में समायोजित किया जाता है। क्योंकि फ्लोरेसेंस धुंधला ज़ेब्राफिश भ्रूण में संवेदनशील नहीं है, यह diaminobezidine (DAB) यहां धुंधला के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है । इस प्रोटोकॉल में, एचएचटी रोगी-व्युत्पन्न आईपीएससी लाइनें जिनमें एक eng उत्परिवर्तन होते हैं, को एंडोथेलियल कोशिकाओं में अंतर किया जाता है। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ एक प्लेट कोटिंग करने के बाद, आईपीएससी-ईसीएस कुओं में मोनोलेयर के रूप में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है। फिर, ट्यूब की लंबाई और शाखाओं की संख्या सूक्ष्म छवियों का उपयोग करके गणना की जाती है। इस प्रकार, इस बेहतर इच्छा प्रोटोकॉल के साथ, यह दिखाया गया है कि कम eng अभिव्यक्ति जेब्राफिश भ्रूण में एंडोथेलियल प्रोजेनिटर गठन को प्रभावित करती है। एचएचटी के साथ एक मरीज से प्राप्त आईपीएससी-ईसीएस का उपयोग करके ट्यूब गठन परख द्वारा इसकी पुष्टि की जाती है। ये परख जल्दी संवहनी विकास में इंग्लैंड के लिए भूमिका की पुष्टि करते हैं ।
Introduction
एचएचटी वाले मरीजों में इंजी (सीडी105) पर सिंगल म्यूटेशन की जानकारी दी गई है। उत्परिवर्तन से ईसी प्रसार में वृद्धि होती है और प्रवाह-मध्यस्थता ईसी विस्तार1,2कम हो जाता है । यह भी पहले बताया गया है कि ENG की कमी जेब्राफिश3में एंडोथेलियल मार्कर अभिव्यक्ति (यानी, केडीआरएल, सीडीएच5, हे2)को कम करती है। एंडोग्लिन,मुख्य रूप से एंडोथेलियल कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, एक ट्रांसम्मेथग्कोप्रोटीन है और विकास कारक (टीजीएफ-ए) परिवार के सदस्यों को बदलने के लिए एक सह-रिसेप्टर के रूप में कार्य करता है। यह ICs4की ओर स्टेम सेल भेदभाव को प्रेरित करने के लिए Id1 अभिव्यक्ति सहित डाउनस्ट्रीम जीन को विनियमित करने के लिए सेल की सतह पर BMP9 बाध्यकारी निर्देश देता है । इस प्रकार, इंग्लैंड जीन वाकुलोजेनेसिस और मानव संवहनी रोग5,6में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । हमने पहले जेब्राफिश भ्रूण में पोत गठन पर एंडोग्लिन नॉकडाउन के प्रभावों की जांच की है, जिसके बाद एक एचएचटी रोगी से प्राप्त आईपीएससी-व्युत्पन्न ईसी का विश्लेषण किया गया है जो एक eng उत्परिवर्तन7असर करते हैं । यह प्रोटोकॉल एंडोथेलियल प्रोजेनिटर मार्कर अभिव्यक्ति और ट्यूब गठन पर ENG की कमी के प्रभाव को दर्शाता है, जो इन विट्रो एंजियोजेनेसिस को मापने के लिए एक मात्रात्मक विधि है।
इंग्लैंड स्थानिक और लौकिक अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए, इच्छा वीवो8में जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए नियोजित है । सीटू संकरण (ईश) में एक निश्चित नमूने में लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड संकर का पता लगाने और कल्पना करने के लिए लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड (डीएनए या एमआरएनए) के पूरक दृश्यों के साथ लेबल जांच का उपयोग करने की एक विधि है। यह प्रक्रिया वीवो में जीन अभिव्यक्ति संकेतों को बढ़ाती है और इसका उपयोग माइक्रोस्कोपी द्वारा जीन की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए किया जाता है। इच्छा व्यापक रूप से विभिन्न मॉडल जानवरों में इस्तेमाल किया गया है, विशेष रूप से जेब्राफिश9में । इसका उपयोग निम्नलिखित डेटा प्राप्त करने के लिए भी किया जाता है: 1) जीन स्थानिक/लौकिक अभिव्यक्ति पैटर्न, जो जीन समारोह और वर्गीकरण के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं; और 2) विशेष रूप से जीन मार्कर है कि उच्च थ्रूपुट दवा या उत्परिवर्ती स्क्रीनिंग10में उपयोग किया जाता है व्यक्त की ।
गुणसूत्र जांच आसानी से सीटू संकरण (सीआईश) में पारंपरिक गुणसूत्र के साथ अपमानित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च पृष्ठभूमि शोर और गैर विशिष्ट संकेत11,12होते हैं । इच्छा विधि दो स्वतंत्र डबल जेड जांच का उपयोग करती है, जो आरएनए दृश्यों को लक्षित करने के लिए संकरण करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। प्रत्येक जांच में लक्ष्य आरएनए के पूरक 18-25 अनुक्रम और 14 आधार पूंछ अनुक्रम (जेड के रूप में संकल्पित) शामिल हैं। लक्ष्य जांच एक जोड़ी (डबल जेड) में उपयोग किया जाता है। दो पूंछ दृश्यों एक साथ preamplifier के लिए एक 28 आधार संकरण साइट है, जो एम्पलीफायर के लिए 20 बाध्यकारी साइटों में शामिल है फार्म । एम्पलीफायर, बदले में, लेबल जांच के लिए 20 बाध्यकारी साइटें शामिल हैं और सैद्धांतिक रूप से प्रत्येक लक्ष्य आरएनए अनुक्रम के लिए 8,000 लेबल तक उपज कर सकते हैं।
यह उन्नत तकनीक ऊतक आकृति विज्ञान13को संरक्षित करते हुए एकल अणु दृश्य को प्राप्त करने के लिए एक साथ संकेत प्रवर्धन और पृष्ठभूमि दमन की सुविधा प्रदान करती है। इच्छा विधियों का आगे संशोधन पिछले शोध14पर आधारित है, जिसमें अतिरिक्त निर्धारण और डीएबी धुंधला शामिल है। बशर्ते यहां एक बेहतर इच्छा प्रोटोकॉल है जो काम कर सकता है भले ही लक्ष्य आरएनए आंशिक रूप से कम हो या अपमानित हो। फायदे में शामिल है कि यह RNase मुक्त शर्तों के बिना 24 घंटे में पूरा किया जा सकता है । सिग्नल ों को एक साथ कई लक्ष्यों के कई चैनलों के माध्यम से भी पता लगाया जा सकता है, और परिणाम विभिन्न उच्च-थ्रूपुट स्वचालन प्लेटफार्मों के परिणामों के अनुरूप और संगत हैं।
पशु मॉडल से परिणाम आवश्यक नहीं है कि मनुष्यों में होता है एक ही घटना को प्रतिबिंबित करते हैं । ENG संरक्षित cysteines, C30-C207 और C53-C182, जो अनाथ क्षेत्रों में disulfide पुलों के रूप में दो जोड़े शामिल हैं । एचएचटी रोगियों में इंग्लैंड की भूमिका का आगे अध्ययन करने के लिए, एचएचटी रोगियों से प्राप्त आईपीएससी के साथ ट्यूब गठन परखों को बिना-इंग्लैंड म्यूटेशन (Cys30Arg, C30R)15के साथ कोशिकाओं में किया गया है । Kubota एट अल के बाद पहली बार ट्यूब गठन प्रयोग16की सूचना दी, परख कई मायनों में विकसित किया गया है । इसका उपयोग एंजियोजेनिक या एंटीएंजियोजेनिक कारकों की पहचान करने, एंजियोजेनेसिस में सिग्नलिंग रास्तों को परिभाषित करने और एंजियोजेनेसिस17को विनियमित करने वाले जीन की पहचान करने के लिए किया गया है।
रोगी से प्राप्त आईपीएससी-ईसीएस की उपलब्धता से पहले, शोधकर्ताओं ने एंजियोजेनसिस16का अध्ययन करने के लिए मुख्य रूप से सुसंस्कृत ईसी का उपयोग किया। हालांकि, एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए, ईसीएस द्वारा गुजरने वाली सीमित मार्ग संख्या के कारण, वायरस के साथ एक्सोजेनस जीन को स्थानांतरित करना एक तकनीकी चुनौती है। इसका कारण यह है कि वहां शायद ही पर्याप्त सेलुलर सामग्री के लिए या तो सर्जरी या मिलान अनुमोदित दाताओं से मानव जहाजों से एकत्र किया जाना है । शिन्या यामानाका द्वारा आईपीएससी उत्पादन तकनीक के आविष्कार के साथ, आईपीएससी से प्राप्त मानव ईसीएस का उपयोग इन विट्रो प्रयोगों में मज़बूती से किया जा सकता है, जैसा कि पहले18की रिपोर्ट दी गई थी।
सीमित संख्या और मार्ग के साथ वायरल ट्रांसड्यूड ईसी का उपयोग संकेत अध्ययनों के लिए पर्याप्त हो सकता है, लेकिन कार्यात्मक अध्ययनों के लिए, म्यूटेंट प्लूरीपोटस्टेम सेल लाइनें उत्पन्न करना बेहतर है, (या तो आईपीएससी या CRISPER/Cas9-लक्षित hESCs), फिर उन्हें एंजियोजेनेसिस अध्ययन के लिए ईसीएस में अंतर करें जो ट्यूब गठन का उपयोग करते हैं19। ट्यूब गठन का उपयोग उत्परिवर्तन वाले एंडोथेलियल कोशिकाओं के कार्य का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल एक माइक्रो-स्लाइड एंजियोजेनेसिस प्लेट पर ट्यूब गठन का भी वर्णन करता है, जो एक आसान, लागत प्रभावी और प्रजनन योग्य विधि है।
नीचे प्रोटोकॉल संवहनी गठन में विशिष्ट जीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय और प्रणालीगत विधि प्रदान करता है, साथ ही वीवो अभिव्यक्ति पैटर्न में विवरण और मानव रोग मॉडलिंग के लिए इन विट्रो कार्यात्मक परिमाणीकरण के साथ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल ने एचएचटी रोगी से प्राप्त आईपीएससी-ईसीएस पर जेब्राफिश और ट्यूब गठन परखों के लिए सीटू आरएनए विश्लेषण मंच में एक बेहतर पूरे माउंट लागू किया। पारंपरिक ईश विधि अतिरिक्त प्रयोगात्मक चरणों के…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन-स्टेम सेल और ट्रांसलेशनल रिसर्च [ग्रांट नंबर 2016YFA0102300(जून यांग के लिए) के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था]; चीन का नेचर साइंस फाउंडेशन [अनुदान संख्या ८१८७००५१, ८१६७००५४ (जून यांग के लिए)]; सीएएमएस इनोवेशन फंड फॉर मेडिकल साइंसेज (सीआईएफएमएस) [ग्रांट नंबर 2016-आई2एम-4-003 (जून यांग तक)]; PUMC युवा पाया और केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान कोष [अनुदान संख्या २०१७३१००१३ (फेंग झोउ के लिए)] ।
Materials
| µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Cell culture |
| Amp 1-FL | ACD | SDS 320852 | Signal Amplification |
| Amp 2-FL | ACD | SDS 320853 | Signal Amplification |
| Amp 3-FL | ACD | SDS 320854 | Signal Amplification |
| Amp 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | Signal Amplification |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Growth factor-reduced Matrigel |
| DEPC | Sigma | D5758 | RNAase-free Water |
| Human Endothelial-SFM | Thermofisher | 11111044 | Cell culture |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed Cells |
| Protease K | ACD | SDS 322337 | Digest tissue |
| Sodium Citrate | Sigma | 6132-04-3 | SSCT solution: Wash Buffer |
| VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Growth factor |
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