Cultura, manipolazione e trapianto ortotopico di organidi tumorali della vescica del topo

Tutte le procedure sono state approvate e condotte secondo le linee guida del Institutional Animal Care and Use Committee presso POSTECH (Numero IACUC: POSTECH-2019-0055). 1. Cultura in vitro degli organoidi tumorali della vescica Stabilire gli organoidi tumorali della vescica dal tumore della vescica murina (Figura 1Un).NOTA: La procedura per la generazione di tumori della vescica del topo indotti da BBN è descritta in Shin et al.17.Fornire 0.1% acqua contenente BBN in una bottiglia scura per mouse ad libitum per 6 mesi. Cambiare l’acqua contenente BBN 2 volte a settimana.NOTA: È stato utilizzato un topo maschio C57BL/6 con un peso corporeo di circa 25 g a 8-10 settimane di età. L’acqua contenente BBN può essere somministrata a un massimo di cinque topi in un’unica gabbia. Dopo 6 mesi, eutanasia il topo utilizzando l’inalazione di anidride carbonica e isolare l’intero tumore della vescica. Trasferirlo in un piatto Petri da 90 mm. Rimuovere le parti non cancerose e le regioni necrotiche utilizzando forbici chirurgiche sterili e lavare i frammenti tumorali della vescica 2-3 volte con la salina (DPBS) tampone di fosfato freddo 1x Dulbecco. Raccogliere i frammenti e trasferirli in un nuovo piatto Petri da 90 mm. Aggiungere 1 mL del mezzo minimo essenziale modificato di Dulbecco (DMEM) con 10 mM 4-(2-idxyethyl)-1-piperazineethaneilfonic acid (HEPES). Mito il tessuto tumorale in pezzi il più piccoli possibile (0,5-1 mm3)utilizzando una lama sterilizzata. Aggiungere 9 mL di DMEM con 10 m/HEPES, 250 g/mL di tipo collagenase I, 250 g/mL di tipo collagenase II e 250 termolisina U/mL. Incubare il tessuto tumorale macinato per 1,5-2 h su uno shaker orbitale in un’incubatrice (37 , 5% CO2) per dissociare i frammenti nella sospensione cellulare. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 mL.NOTA: Se la dimensione del tumore raccolto dal topo è superiore a 1 cm3, trattarlo con 2 volte la quantità di termolisina o aumentare il tempo di incubazione. Centrifugare il tubo a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e aspirare il supernatante. Risospendere il pellet utilizzando 5 mL di clouro-potassio-potassio (ACK) lysing buffer per liizzare eventuali globuli rossi. Incubare il tubo per 3-5 min a temperatura ambiente (RT) fino alla lis completa dei globuli rossi.NOTA: Se i globuli rossi non sono osservati, omettere il processo di liscivia. Aggiungere 20 mL di DMEM nel tubo. Centrifugare il tubo a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e aspirare il supernatante. Risospendere il pellet con 1 mL di 0,25% Trypsin-EDTA e 10 dihydrochlride (Y-27632) per dissociare il pellet in singole celle. Incubare il tubo per 5 min in un bagno d’acqua a 37 gradi centigradi.NOTA: Osservare il tumore al microscopio per confermare la completa dissociazione in singole cellule. Se blocchi di cellule persistono, pipette ulteriormente la sospensione. Neutralizzare la trypsin utilizzando 10 mL di DMEM con il 10% di siero bovino fetale (FBS). Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cellulare di 100 m su un nuovo tubo da 50 mL per rimuovere i detriti non digeriti. Centrifugare il tubo a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e aspirare il supernatante. Rivestire un pozzo in una piastra di 24 pozze utilizzando 150 -L di fattore di crescita del freddo ghiaccio ridotto matrice della membrana seminterrato (Tabella dei materiali) e posizionare la piastra 24 pozzo in un’incubatrice (37 c, 5% CO2) per 30 min per solidificare la matrice della membrana seminterrato.NOTA: Scongelare e mantenere la matrice della membrana del seminterrato a 4 gradi centigradi per evitare la solidificazione prima dell’uso. Risospendere il pellet utilizzando 1 mL di DMEM e contare le celle utilizzando un emocitometro. Trasferire 3-4 x 104 cellule tumorali in un microtubo da 1,5 mL sul ghiaccio. Centrifugare il microtubo a 400 x g per 3 min a 4 gradi centigradi e scartare con cura il supernatante. Risospendere le cellule con 500 o luna di mezzo organoide preriscaldato (Tabella 1) e 10 -M Y-27632 e trasferirle nel pozzo rivestito. Mettere la piastra 24 in un’incubatrice (37 gradi centigradi, 5% CO2). Le cellule tumorali extra della vescica possono essere rifornite con 1 mL di DMEM contenenti 10% FBS, 1% penicillina /streptomicina e 10% di anidride dimetilico (DMSO) in crioviali 1,5 mL. Mettetele in un contenitore di congelamento crioviale e trasferite il contenitore in un congelatore a -80 gradi centigradi. Dopo lo stoccaggio nel congelatore durante la notte, trasferire i crioviali in azoto liquido per lo stoccaggio a lungo termine. Modificare il mezzo ogni 2 giorni utilizzando 500 l di mezzo organoide preriscaldato (Figura 1B). organoidi tumorali della vescica della sottocoltura.NOTA: Si raccomanda il passaggio degli organoidi tumorali della vescica quando raggiungono i 100-150 m di diametro. Aggiungere 500 -L L di collagenano/dispasi al mezzo organoide nella piastra di 24 po’ con organoidi tumorali. Pipetta su e giù per la matrice della membrana seminterrato e il mezzo. Incubare per 20 min a 37 s e raccogliere le cellule in un tubo da 15 mL.NOTA: Esaminare gli organoidi isolati dalla matrice della membrana del seminterrato al microscopio. Se gli organoidi non sono staccati dalla matrice della membrana del seminterrato, aumentare il tempo di incubazione o pipette più volte. Aggiungere 5 mL di DMEM preriscaldato, centrifugare il tubo a 400 x g per 3 min a 4 gradi centigradi, e aspirare il supernatante. Risospendere il pellet utilizzando 1 mL di trypsin-EDTA preriscaldato 0,25% e 10 -M Y-27632. Incubare per 5 min in un bagno d’acqua a 37 gradi centigradi. Pipette vigorosamente le cellule su e giù e neutralizzare la trypsin utilizzando 5 mL di DMEM con 10% FBS. Centrifugare il tubo a 400 x g per 3 min a 4 gradi centigradi e aspirare il supernatante. Risospendere il pellet utilizzando 1 mL di mezzo organoide preriscaldato e contare il numero di singole cellule tumorali. Ripetere i passaggi 1.1.14-1.1.18. 2. Manipolazione genetica degli organiidi tumorali della vescica utilizzando la trasduzione mediata dal lentivirus (Figura 2A) Produrre le particelle lentivirali che esprimono GFP. Il giorno 0, piastra HEK 293T cellule ad una densità di 5–6 x 106 celle per 10 cm piastra di coltura cellulare nel mezzo di coltura della linea cellulare (cioè, DMEM con 10% FBS e 1% penicillina / streptomicina). Il primo giorno, preparare la soluzione di trasfezione del DNA, compreso il plasmide di trasferimento contenente GFP (8 g), il plasmide di imballaggio lentivirale (10 g di pCMVR 8,74 e 3 g di pMD2.G) e 1 mL di supporto siero ridotto(Tabella dei materiali). Aggiungere 3 -L di reagente di trasfezione (Tabella dei materiali) per 1 g di plasmide totale secondo le istruzioni del produttore e mescolare delicatamente pipettando. Incubare per 20 min a RT e aggiungere 9 mL di DMEM con 10% FBS. Aspirare il mezzo di coltura nella piastra di coltura cellulare con cellule HEK 293T. Trasferire con attenzione 10 mL della soluzione di trasfezione del DNA sulle cellule HEK 293T e incubare in un’incubatrice a coltura cellulare a 37 gradi centigradi. Il terzo giorno, osservare le cellule al microscopio a fluorescenza (eccitazione a 488 nm ed emissione a 512 nm) per determinare l’efficienza della trasfezione. Quasi il 90%–100% delle cellule dell’intera popolazione cellulare dovrebbe esprimere GFP. Raccogliere il supernatante (contenente il virus) e filtrare il supernatante con un filtro di poliethersulfone (PES) di 0,45 m.NOTA: Utilizzare un filtro a basso legame proteico, ad esempio un filtro PES. Per concentrare il virus, centrifugare il supernatante del virus a 98.768 x g in un’ultracentrifuga per 2 h a 4 gradi centigradi in un rotore a benna oscillante (Tabella dei materiali) e scartare con cura il supernatante. Risospendere il pellet in 2,5 mL di mezzo organoide freddo. Per lo stoccaggio a lungo termine, aliquote di 250 gradi di mezzo lentivirale in fiale criogeniche e bloccarle a scatto usando azoto liquido. Conservare le scorte virali congelate in un congelatore a -80 gradi centigradi. Eseguire la trasduzione mediata da lentivirus degli organoidi tumorali della vescica. Il giorno 2, dividere gli organoidi tumorali come descritto sopra (passaggio 1.2) 12 h prima della trasduzione mediata dal lentivirus. Il giorno 3, scongelare rapidamente un virus (passo 2.1.9) contenente un virus in un bagno d’acqua a 37 gradi centigradi e aggiungere i 250 gradi di mezzo organoide con 10 SM Y-27632 e 8 bromdie di esadimethrina. Sostituire il mezzo organoide nella piastra di 24 pozze con organoidi tumorali di 500 – L di mezzo contenente virus e incubare per 12–16 h in un’incubatrice (37 gradi centigradi, 5% CO2). Il giorno 4, cambiare il mezzo con 500 litri di mezzo organoide fresco.NOTA: Dopo 12-16 h di incubazione, il mezzo deve essere cambiato, perché il mezzo contenente lentivirus e bromuro di esadimettosina è citotossico. Il giorno 6, monitorare il segnale GFP dagli organoidi tumorali 3 giorni dopo la trasduzione al microscopio a fluorescenza (Figura 2B). Il giorno 10, passare e immagazzinare gli organoidi 7 giorni dopo la trasduzione come descritto al punto 1.2, per mantenere le linee organotumidi geneticamente modificate. 3. Trapianto ortotopico di organiide della vescica(Figura 3A) Preparare gli organoidi tumorali della vescica per il trapianto ortotopico. Prima del trapianto, coltura degli organoidi tumorali della vescica per 5-7 giorni, come descritto sopra (passaggio 1.2). Aggiungere 500 -L l di collagenano/dispasi al mezzo organoide in una piastra di 24 pozze con gli organoidi tumorali. Pipetta su e giù per la matrice di membrana seminterrato e mezzo. Incubare per 20 min a 37 s e raccogliere le cellule in un tubo da 15 mL. Aggiungere 5 mL di DMEM preriscaldato, centrifugare il tubo a 400 x g per 3 min a 4 gradi centigradi, e aspirare il supernatante. Risospendere il pellet con 1 mL di DMEM e trasferire la soluzione in una parabola Petri da 90 mm. Al microscopio, raccogliere gli organoidi tumorali 10-100 utilizzando una micropipetta p200 e raccoglierli in un microtubo sul ghiaccio. Centrifugare il tubo a 400 x g per 3 min a 4 gradi centigradi e scartare con cura il supernatante. Mantenere il pellet cellulare sul ghiaccio fino a quando i topi sono pronti per l’intervento chirurgico. Trapianto di parete della vescica submucosaleNOTA: questa procedura viene modificata dal protocollo pubblicato da Fu et al18. Prepara un topo nudo maschile da 8 a 10 settimane (CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl) almeno 1 settimana prima dell’esperimento per permettergli di acclimatarsi a un nuovo ambiente. Iniettare enrofloxacin (5 mg/kg) sottocutaneamente 24 h prima dell’intervento chirurgico. Pulire la superficie del panca con acqua e sapone. Autoclave gli strumenti chirurgici prima della procedura chirurgica ed eseguire la chirurgia utilizzando strumenti sterili. Mantenere la siringa di insulina 29 G, punte pipette, e matrice di membrana seminterrato sul ghiaccio. Somministrare il chetoprofene (5 mg/kg) sottocutaneamente prima della somministrazione di anestesia. Anestesizzare il topo con 4% isoflurane in una camera di induzione. Una volta ottenuta l’anestesia generale, posare il topo in una posizione supina e mantenere l’anestesia per inalazione di maschera del 2% di isoflurane vaporizzato.NOTA: Se il tempo di anestesizzazione è superiore a 30 min, applicare l’unguento degli occhi a entrambi gli occhi utilizzando un tampone di cotone per evitare l’essiccazione corneale. Applicare povidone-iodio con una garza sterile e pulirlo con 70% di etanolo. Ripetere 3x con una nuova garza o un tampone di cotone ogni volta. Coprire l’ano e il campo chirurgico utilizzando tende chirurgiche usa e getta e sterili. Utilizzando un microscopio dissettivo per l’ingrandimento, fare una piccola incisione trasversale (più piccola di 1,5 cm) nella pelle e parete muscolare dell’addome della linea mediana inferiore con forbici chirurgiche sterili. Esporre la vescica dalla cavità addominale e sostenerla con tamponi di cotone imbevuti di salina.NOTA: Se la vescica è piena di urina, premere delicatamente la vescica per decomprimerla leggermente. Risospendere i pellet organoidi (passaggio 3.1.7) in 80 gradi di mezzo organoide contenente il 50% di matrice di membrana basement ad alta concentrazione (Tabella dei materiali). Iniettare la sospensione organoide nell’aspetto anteriore della cupola della vescica utilizzando la siringa insulinica 29 G al microscopio dissetante. Chiudere lo strato interno della parete addominale con sutura antibatterica assorbibile e quindi chiudere lo strato esterno con sutura in nylon 4-0. Disinfettare il sito chirurgico con povidone-iodio e 70% di etanolo. Permettere al topo di recuperare sotto un irradiatore infrarosso 10-15 min. Monitorare il topo fino a quando non riacquista coscienza e motilità. Un giorno dopo l’intervento chirurgico, controllare le condizioni generali del topo e perdite anatomotiche. Somministrare il ketoprofene (5 mg/kg) una volta al giorno per 3 giorni post-operatori e trattare l’enrofloxacina (5 mg/kg) una volta al giorno per 10 giorni post-operatori. Quando il sito di incisione è guarito (10-14 giorni dopo l’intervento chirurgico), rimuovere le suture. Monitorare la crescita del tumore della vescica del topo per 2–3 settimane dopo l’iniezione di organoide tumorale. Se si osserva la crescita del tumore della vescica, eutanasia il topo utilizzando l’inalazione di anidride carbonica, e raccogliere l’intero tumore della vescica. Lavarlo con DPBS freddo (Figura 3B)16. Per analizzare l’istologia del tumore della vescica, macchiare la sezione incorporata in paraffina del tessuto utilizzando ematossina e eosina (H ed E) colorazione (Figura 3B)16.