תרבות, מניפולציה, והשתלת אורתוגרטופית של שלפוחית השתן של העכבר הגידול אורגנואידים

כל ההליכים אושרו ונערכו תחת ההנחיות של טיפול בעלי חיים מוסדיים ולהשתמש בוועדה POSTECH (מספר IACUC: POSTECH-2019-0055). 1. תרבות מבחנה של אורגנואידים גידול שלפוחית השתן להקים אורגנואידים גידול שלפוחית השתן מן הגידול בשלפוחית השתן murine (איור 1קצת).הערה: ההליך ליצירת BBN המושרה גידולים בשלפוחית העכבר מתואר ב שין et al.17.לספק 0.1% BBN המכילים מים בבקבוק כהה כדי להעביר את מודעת העכבר למשך 6 חודשים. לשנות את BBN המכיל מים 2x בשבוע.הערה: עכבר זכר C57BL/6 עם משקל הגוף של כ 25 גרם ב 8 – 10 שבועות של גיל שימש. ניתן לערוך מים המכילים את BBN עד חמישה עכברים בכלוב אחד. לאחר 6 חודשים, המתת החסד העכבר באמצעות שאיפת פחמן דו חמצני לבודד את גידול שלפוחית השתן כולה. . להעביר אותו לצלחת פטרי 90 מ”מ הסרת חלקים שאינם סרטניים ואזורי נמק באמצעות מספריים כירורגי סטרילי ולשטוף את שברי הגידול שלפוחית השתן 2 – 3 פעמים עם תמיסת מלח באגירה ושות של מלוחים 1x הקרה (DPBS). אספו את השברים והעבירו אותם לצלחת פטרי חדשה 90 מ”מ. להוסיף 1 מ ל של מדיום מינימום שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10 מ”מ 4-(2-הידרוקסיל) -1-piperazinefonic חומצה (HEPES). האוהב את רקמת הגידול לחתיכות קטנות ככל האפשר (0.5 – 1 מ”מ3) באמצעות להב תער מעוקר. הוסף 9 מ ל של Dמאמ עם 10 מ”מ HEPES, 250 μg/mL קולגן סוג אני, 250 μg/mL קולגן סוג II, ו 250 U/mL thermolysin. דגירה רקמות הגידול טחון עבור 1.5 – 2 h על שייקר מסלולית באינקובטור (37 ° צ’, 5% CO2) כדי לנתק את השברים לתוך ההשעיה התא. להעביר את ההשעיה התא לתוך צינור 50 mL.הערה: אם גודל הגידול שנקטפו מן העכבר הוא גדול מ 1 ס מ3, לטפל בו עם 2x את כמות thermolysin או להגדיל את זמן הדגירה. צנטריפוגה את הצינור ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ומכה את סופרנטאנט. השהה מחדש את הגלולה באמצעות 5 מ ל של אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) לישיר מאגר לlysing כל כדוריות הדם האדומות. מודיית את השפופרת עבור 3 – 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) עד הפירוק המלא של כדוריות הדם האדומות.הערה: אם תאי הדם האדומים אינם מצופים, השמט את תהליך lysing. הוסף 20 מ ל של DMEM לתוך השפופרת. צנטריפוגה את הצינור ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ומכה את סופרנטאנט. להשעות מחדש את הגלולה עם 1 מ ל של 0.25% טריפסין-EDTA ו 10 μM Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון (Y-27632) לנתק את הגלולה לתוך תאים בודדים. מודקון את הצינור עבור 5 דקות באמבט מים 37 ° c.הערה: שימו לב לגידול שמתחת למיקרוסקופ כדי לאשר את הדיסוציאציה המוחלטת לתאים בודדים. אם גושי תאים ממשיכים, ההשעיה נוספת. נטרל טריפסין באמצעות 10 מ ל של DMEM זיכרון עם 10% סרום העובר (FBS). לסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 100 יקרומטר על שפופרת חדש 50 mL כדי להסיר את הפסולת מתעכל. צנטריפוגה את הצינור ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c ומכה את סופרנטאנט. מעיל טוב בצלחת 24 הבאר באמצעות 150 μL של מקדם גידול קרח קר מופחתת מטריקס קרום המרתף (הטבלה של חומרים) ומניחים את הצלחת 24 טוב באינקובטור (37 ° צ’, 5% CO2) עבור 30 דקות כדי לגבש את מטריצת קרום המרתף.הערה: הפשרת ושמירה על מטריצת הממברנה בקומת המרתף ב-4 ° צ’ כדי למנוע העצמה לפני השימוש. השהה מחדש את הגלולה באמצעות 1 mL של DMEM ולספור את התאים באמצעות הומוציטוטומטר. העברה 3 – 4 x 104 תאים סרטניים לתוך מיקרוtube 1.5 mL על הקרח. צנטריפוגה את המיקרוצינורית ב 400 x g עבור 3 דקות ב 4 ° c ובזהירות למחוק את supernatant. להשעות מחדש את התאים עם 500 μL של בינונית מראש אורגנואיד (טבלה 1) ו 10 Μm Y-27632 ולהעביר אותם לבאר מצופה. מניחים את הצלחת 24 הבאר באינקובטור (37 ° c, 5% CO2). תאים סרטניים נוסף שלפוחית השתן יכול להיות מצויד עם 1 מ ל של DMEM המכיל 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, ו 10% diמתיל סולפוקסיד (DMSO) ב 1.5 mL קריובקבוקונים. והעבירו את המיכל למקפיא. של 80 ° c לאחר האחסון במקפיא לילה, להעביר את הקריובקבוקונים לתוך חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. שנה את המדיום כל 2 ימים באמצעות 500 μL של מדיום טרום-שחומם (איור 1B). . גידול בשלפוחית השתן של תת-תרבותהערה: מעבר של גידול שלפוחית השתן אורגנואידים כאשר הם מגיעים 100 – 150 יקרומטר בקוטר מומלץ. הוסף 500 μL של הקוליואז/dispcase למדיום אורגאיד בצלחת 24 הטוב עם אורגנואידים הגידול. , פיפטה למעלה ולמטה. מטריצת הקרום והמדיום מודקון למשך 20 דקות ב 37 ° c ו למסוק את התאים לתוך שפופרת 15 מ ל.הערה: בדוק את האורגנואידים מבודדים מתוך מטריצת קרום המרתף תחת מיקרוסקופ. אם האורגנואידים אינם מנותקים מתוך מטריצת קרום המרתף, הגדילו את זמן הדגירה או הפיפטה יותר פעמים. הוסף 5 מ ל של מחמם לקדם, צנטריפוגה את הצינור ב 400 x g עבור 3 דקות ב 4 ° c, ו לבשל את supernatant. להשעות מחדש את הגלולה באמצעות 1 מ ל של prewarmed 0.25% טריפסין-EDTA ו 10 μM Y-27632. מודטה עבור 5 דקות באמבט מים 37 ° c. צינורות במרץ התאים למעלה ולמטה ולנטרל את טריפסין באמצעות 5 מ ל של DMEM זיכרון עם 10% FBS. צנטריפוגה את הצינור ב 400 x g עבור 3 דקות ב 4 ° c ומכה את סופרנטאנט. השהה מחדש את הגלולה באמצעות 1 מ ל של בינונית מראש אורגנואיד ולספור את מספר התאים הסרטניים בודד. חזור על שלבים 1.1.14-1.1.18. 2. מניפולציה גנטית של הגידול שלפוחית השתן אורגנואידים באמצעות וירוס-התמרה בתיווך (איור 2א) מייצרים את החלקיקים. האנטי-ויראליות של הביטוי ביום 0, צלחת HEK 293T תאים בצפיפות של 5 – 6 x 106 תאים לכל 10 ס מ התרבות התא לוחית התרבות קו התא בינונית (כלומר, DMEM זיכרון עם 10% fbs ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין). ביום 1, להכין את הפתרון מעבר DNA כולל העברת הפלסטיק המכיל GFP (8 μg), האריזה ויראלי פלמיד (10 μg של pCMVR 8.74 ו-3 μg של pMD2. G), ו 1 mL של סרום מופחת בינונית (לוח חומרים). הוסף 3 μL של העברה מגיב (טבלת חומרים) עבור 1 μg של הפלסטיות הכולל על פי הוראות היצרן ולערבב בעדינות על ידי ליטוף. מודטה עבור 20 דקות ב RT ולהוסיף 9 מ ל של dmem זיכרון עם 10% FBS. מנושף את מדיום התרבות בצלחת תרבות התא עם התאים HEK 293T. בזהירות להעביר 10 מ ל של הפתרון העברת ה-DNA על התאים HEK 293T ו-דגירה בחממה תרבות התא ב 37 ° c. ביום 3, להתבונן בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית (עירור על 488 ננומטר ופליטה ב 512 ננומטר) כדי לקבוע את היעילות הטרנסאפילנטית. כמעט 90%-100% של התאים באוכלוסייה התא כולו צריך לבטא GFP. לאסוף את supernatant (המכיל את הווירוס) ו פילטרט את supernatant עם 0.45 יקרומטר polyethersulfone (PES) מסנן.הערה: השתמש במסנן של איגוד חלבונים נמוך, כגון מסנן PES. כדי לרכז את הווירוס, צנטריפוגה את הווירוס supernatant ב 98,768 x g ב ultracentrifuge עבור 2 h ב 4 ° c ב רוטור דלי מנופף (טבלה של חומרים) ובזהירות להיפטר supernatant. השהה מחדש את הגלולה ב-2.5 מ ל של בינונית-אורגאידית קרה. לאחסון לטווח ארוך, סדרת מחלקים 250 μl של בינוני ויראלי לתוך מבחנות קריוגניים ולהצמיד-להקפיא אותם באמצעות חנקן נוזלי. לאחסן את המניות ויראלי קפוא במקפיא-80 ° c. לבצע את התמרה-בתיווך של הסרטן שלפוחית השתן אורגנואידים. ביום 2, לפצל את אורגנואידים הגידול כפי שמתואר לעיל (שלב 1.2) 12 h לפני התמרה בתיווך-וירוס. ביום 3, במהירות להפשיר סדרת מחלקים (שלב 2.1.9) המכיל וירוס באמבט מים 37 ° c ולהוסיף 250 μl של בינוני אורגנואיד עם 10 μm Y-27632 ו-8 μg/mL הקסאדין ברומיד. להחליף את המדיום אורגאיד ב 24 צלחת עם האורגנואידים הגידול על ידי 500 μL של וירוס המכיל בינונית ו-דגירה עבור 12-16 h בחממה (37 ° c, 5% CO2). ביום 4, לשנות את המדיום עם 500 μL של מדיום אורגנואיד טרי.הערה: לאחר 12 – 16 מתוך הדגירה, יש לשנות את המדיום, כי המדיום המכיל את הנגיף וההקאדימורין ברומיד הוא ציטוטוקזה. ביום 6, לעקוב אחר האות GFP מאורגנואידים הגידול 3 ימים לאחר התמרה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית (איור 2B). ביום 10, מעבר ומניות האורגנואידים 7 ימים לאחר התמרה כמתואר בשלב 1.2, כדי לשמור על שינוי גנטי שונה הגידול הקווים. 3. השתלת אורתוטופית של שלפוחית השתן אורגאיד (איור 3א) להכין את הגידול שלפוחית השתן אורגנואידים להשתלה אורתוגרפית. לפני ההשתלה, תרבות הגידול שלפוחית השתן אורגנואידים עבור 5 – 7 ימים, כפי שמתואר לעיל (שלב 1.2). הוסף 500 μL של הקוליואז/dispcase למדיום אורגאיד בצלחת 24 היטב עם אורגנואידים הגידול. , פיפטה למעלה ולמטה. מטריצת קרום המרתף והמדיום דגירה של 20 דקות ב 37 ° צ’ ולאסוף את התאים לתוך שפופרת 15 מ ל. הוסף 5 מ ל של מחמם לקדם, צנטריפוגה את הצינור ב 400 x g עבור 3 דקות ב 4 ° c, ו לבשל את supernatant. השהה מחדש את הגלולה עם 1 מ ל של DMEM ולהעביר את הפתרון לתוך צלחת פטרי 90 מ”מ. תחת מיקרוסקופ, להרים את 10-100 אורגנואידים הגידול באמצעות מיקרופיפטה p200 ולאסוף אותם לתוך מיקרוצינורית על הקרח. צנטריפוגה את הצינור ב 400 x g עבור 3 דקות ב 4 ° c ובזהירות לבטל את supernatant. לשמור על הגלולה תא על הקרח עד העכברים מוכנים לניתוח. שלפוחית השתן submucosal השתלת קירהערה: הליך זה משתנה מהפרוטוקול שפורסם על ידי פו et al18. הכינו מגבר בן 8 עד 10 שבועות בעירום גברי (CAnN. Cg-Foxn1nu/Crl) לפחות שבוע לפני הניסוי כדי לאפשר לו לבצע האקלים בסביבה חדשה. הכנס enrofloxacin (5 מ”ג/ק”ג) תת-עורי 24 שעות לפני הניתוח. נקו את משטח הספסל באמצעות סבון ומים. אוטוקלב כלים כירורגיים לפני הליך כירורגי ולבצע ניתוח באמצעות כלי סטרילי. שמור על 29 מזרק אינסולין, פיפטה, ומטריצת קרום המרתף על הקרח. ניהול ketoprofen (5 מ”ג/ק”ג) תת-עורי לפני הניהול של הרדמה. . שיהיה בחדר האינדוקציה לאחר הרדמה כללית השיגה, להניח את העכבר במצב פרקדן ולשמור על הרדמה על ידי שאיפת מסכה של 2% מתאדה isofלאנה.הערה: אם זמן ההרדמה הוא מעל 30 דקות, להחיל משחה העין על שתי העיניים באמצעות ספוגית כותנה כדי למנוע ייבוש הקרנית. החל povidone-יוד עם גזה סטרילית ולנגב אותו עם 70% אתנול. חזור על 3x עם גזה חדש או לנקות כותנה בכל פעם. כסו את פי הטבעת ואת השדה כירורגי באמצעות וילונות חד פעמיות, סטרילי. באמצעות מיקרוסקופ מבתר להגדלה, לעשות חתך רוחבי קטן (קטן יותר מ 1.5 ס מ) בעור וקיר שרירי הבטן התחתונה באמצע הדרך עם מספריים כירורגי סטרילי. לחשוף את שלפוחית השתן מחלל הבטן ולתמוך בו עם מטליות כותנה ספוג מלוחים.הערה: אם שלפוחית השתן מלאה בשתן, לחץ בעדינות על שלפוחית השתן כדי לשחרר אותו מעט. השהה מחדש את כדורי ה-אורגנואיד (שלב 3.1.7) ב-80 μL של מדיום אורגנואיד המכיל 50% מטריצת ממברנה בעלת ריכוז גבוה (טבלת חומרים). הכנס את ההשעיה הארגונית לתוך ההיבט הקדמי של כיפת שלפוחית השתן באמצעות 29 G מזרק אינסולין תחת מיקרוסקופ מבתר. סגור את השכבה הפנימית של קיר הבטן עם תפר אנטיבקטריאלי הנספג ולאחר מכן לסגור את השכבה החיצונית עם 4-0 ניילון תפר. לחטא את האתר כירורגי עם povidone-יוד ו 70% אתנול. אפשר לעכבר להתאושש תחת הסקה אינפרא אדום 10 – 15 דקות. נטר את העכבר עד שהוא חוזר להכרה ולתנועתיות. יום אחד לאחר הניתוח, לבדוק את המצב הכללי של העכבר ואת הדליפה anastomotic. ניהול ketoprofen (5 מ”ג/ק”ג) פעם ביום עבור 3 ימים לאחר הניתוח ולטפל enrofloxacin (5 מ”ג/ק”ג) פעם ביום עבור 10 ימים לאחר הניתוח. כאשר החתך האתר נרפא (10-14 ימים לאחר הניתוח), להסיר את התפרים. ניטור התפתחותם של גידול שלפוחית השתן של העכבר עבור 2 – 3 שבועות לאחר הזרקה אורגאיד הגידול. אם גידול שלפוחית השתן הוא נצפתה, המתת חסד העכבר באמצעות שאיפת פחמן דו חמצני, והקציר של גידול שלפוחית השתן כולה. שטוף אותו באמצעות דPBS קר (איור 3ב)16. כדי לנתח את הגידול שלפוחית השתן היסטולוגיה, כתם את הקטע פרפין-מוטבע של הרקמה באמצעות המטאוקסילין ו אאוזין (H ו-E) צביעת (איור 3ב)16.