Cultuur, manipulatie en orthotopische transplantatie van mouse bladder tumor organoïden

Alle procedures zijn goedgekeurd en uitgevoerd in het kader van de richtlijnen van het Institutioneel Comité voor dierenverzorging en -gebruik van POSTECH (IACUC-nummer: POSTECH-2019-0055). 1. In vitro cultuur van blaastumor organoïden Vaststellen blaastumor organoïden van de murine blaastumor (Figuur 1A).OPMERKING: De procedure voor het genereren van BBN-geïnduceerde muisblaastumoren wordt beschreven in Shin et al.17.Zorg 6 maanden lang voor 0,1% BBN-bevattend water in een donkere fles aan muisad libitum. Wijzig 2x per week BBN-bevattend water.OPMERKING: Er werd een C57BL/6 mannelijke muis met een lichaamsgewicht van ongeveer 25 g bij 8-10 weken oud gebruikt. BBN-bevattend water kan worden toegediend aan maximaal vijf muizen in één kooi. Na 6 maanden, euthanaseren van de muis met behulp van kooldioxide inademing en isoleren van de gehele blaastumor. Breng het naar een 90 mm petrischaal. Verwijder niet-kankerachtige delen en necrotische gebieden met behulp van steriele chirurgische schaar en was de blaastumorfragmenten 2-3 keer met koude 1x Dulbecco’s fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS). Verzamel de fragmenten en breng ze naar een nieuwe 90 mm Petrischaal. Voeg 1 mL van Dulbecco’s gemodificeerde minimale essentiële medium (DMEM) toe met 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfoonzuur (HEPES). Hak het tumorweefsel zo klein mogelijk in stukken (0,5–1 mm3)met behulp van een gesteriliseerd scheermesje. Voeg 9 mL DMEM toe met 10 mM HEPES, 250 μg/mL collagenase type I, 250 μg/mL collagenase type II en 250 U/mL thermolysine. Incubeer het gehakte tumorweefsel gedurende 1,5-2 uur op een orbitale shaker in een couveuse (37 °C, 5% CO2) om de fragmenten te scheiden in de celsuspensie. Breng de celvering over in een buis van 50 mL.OPMERKING: Als de grootte van de tumor geoogst van de muis groter is dan 1 cm3,behandelen met 2x de hoeveelheid thermolysine of verhoging van de incubatietijd. Centrifugeer de buis op 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C en zuig de supernatant aan. Resuspend de pellet met behulp van 5 mL ammoniumchloride-kalium (ACK) lysing buffer om eventuele rode bloedcellen lyse. Incubeer de buis gedurende 3-5 min bij kamertemperatuur (RT) tot de volledige lyse van rode bloedcellen.OPMERKING: Als de rode bloedcellen niet worden waargenomen, laat het lysingproces weg. Voeg 20 mL DMEM toe aan de buis. Centrifugeer de buis op 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C en zuig de supernatant aan. Zet de pellet opnieuw op met 1 mL van 0,25% Trypsin-EDTA en 10 μM Y-27632 dihydrochloride (Y-27632) om de pellet te scheiden in enkele cellen. Incubeer de buis gedurende 5 min in een waterbad van 37 °C.OPMERKING: Observeer de tumor onder een microscoop om volledige dissociatie in enkele cellen te bevestigen. Als er stukjes cellen aanhouden, pipeter de suspensie verder. Neutraliseer trypsine met 10 mL DMEM met 10% foetaal runderserum (FBS). Filtreer de celvering door een 100 μm celzeef op een nieuwe buis van 50 mL om het onverteerd puin te verwijderen. Centrifugeer de buis op 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C en zuig de supernatant aan. Bestrijk een put in een 24 putplaat met 150 μL aan ijskoude groeifactor verminderde keldermembraanmatrix(Tabel met materialen)en plaats de 24 putplaat in een couveuse (37 °C, 5% CO2)gedurende 30 min om de keldermembraanmatrix te stollen.LET OP: Ontdooi en onderhoud de matrix van het keldermembraan bij 4 °C om stolling voor gebruik te voorkomen. Resuspend de pellet met behulp van 1 mL DMEM en tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Breng 3-4 x 104 tumorcellen over in een 1,5 mL microtube op ijs. Centrifugeer de microbuis op 400 x g gedurende 3 min bij 4 °C en gooi de supernatant voorzichtig weg. Zet de cellen opnieuw op met 500 μL voorverwarmd organoïde medium(tabel 1) en 10 μM Y-27632 en breng ze over in de gecoate put. Plaats de 24 putplaat in een couveuse (37 °C, 5% CO2). Extra blaastumorcellen kunnen worden gevuld met 1 mL DMEM met 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine en 10% dimethylsulfoxide (DMSO) in 1,5 mL cryovials. Plaats ze in een cryoviale vriescontainer en breng de container over naar een vrieskist van -80 °C. Na de opslag in de vriezer ‘s nachts, breng de cryovials in vloeibare stikstof voor langdurige opslag. Verander het medium om de 2 dagen met 500 μL voorverwarmde organoïde medium (figuur 1B). Subcultuur blaastumor organoïden.OPMERKING: Passage van blaastumororganoïden wanneer ze 100-150 μm in diameter bereiken wordt aanbevolen. Voeg 500 μL collageenase/dispase toe aan het organoïde medium in de 24-putplaat met tumororganoïden. Pipetteer op en neer de kelder membraan matrix en het medium. Incubeer gedurende 20 min bij 37 °C en oogst de cellen in een buis van 15 mL.OPMERKING: Onderzoek de organoïden geïsoleerd van de kelder membraan matrix onder een microscoop. Als de organoïden niet losstaan van de matrix van het keldermembraan, verhoogt u de incubatietijd of pipet vaker. Voeg 5 mL voorverwarmde DMEM toe, centrifugeer de buis op 400 x g gedurende 3 min bij 4 °C en zuig de supernatant aan. Resuspend de pellet met behulp van 1 mL voorverwarmde 0,25% trypsin-EDTA en 10 μM Y-27632. Incubeer gedurende 5 min in een waterbad van 37 °C. Pipet de cellen krachtig op en neer en neutraliseer de trypsine met 5 mL DMEM met 10% FBS. Centrifugeer de buis op 400 x g gedurende 3 min bij 4 °C en zuig de supernatant aan. Resuspend de pellet met behulp van 1 mL van voorverwarmde organoïde medium en tel het aantal enkele tumorcellen. Herhaal stap 1.1.14−1.1.18. 2. Genetische manipulatie van blaastumororganoïden Met behulp van Lentivirus-gemedieerde transductie(figuur 2A) Produceer de GFP-uitdrukkende lentivirale deeltjes. Op dag 0, plaat HEK 293T cellen met een dichtheid van 5-6 x 106 cellen per 10 cm celkweekplaat in cellijn kweekmedium (d.w.z. DMEM met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine). Bereid op dag 1 de DNA-transfectionoplossing voor, inclusief overdrachtsplasmid met GFP (8 μg), lentivirale verpakkingsplasmid (10 μg pCMVR 8,74 en 3 μg pMD2.G) en 1 mL verlaagd serummedium(Tabel met materialen). Voeg 3 μL transfection reagens (Tabel van materialen) per 1 μg van totale plasmid volgens de instructies van de fabrikant en meng zachtjes door pipetteren. Incubeer voor 20 min bij RT en voeg 9 mL DMEM toe met 10% FBS. Aanzuigen van de cultuur medium in de cel cultuur plaat met HEK 293T cellen. Breng 10 mL van de DNA-transfection-oplossing voorzichtig over op de HEK 293T-cellen en incubeer in een celkweekincubator bij 37 °C. Op dag 3, observeer de cellen onder een fluorescentiemicroscoop (opwinding op 488 nm en emissie bij 512 nm) om de transfection-efficiëntie te bepalen. Bijna 90%–100% van de cellen in de gehele celpopulatie moet GFP uitdrukken. Verzamel de supernatant (met het virus) en filtraat de supernatant met een 0,45 μm polyethersulfon (PES) filter.OPMERKING: Gebruik een eiwitarm filter, zoals een PES-filter. Om het virus te concentreren centrifugeer het virus supernatant op 98.768 x g in een ultracentrifuge gedurende 2 uur bij 4 °C in een swingende emmerrotor (Tabel met materialen) en gooi het supernatant zorgvuldig weg. Resuspend de pellet in 2,5 mL koud organoïde medium. Voor langdurige opslag, aliquot 250 μL lentiviraal medium in cryogene flacons en snap-vries ze met behulp van vloeibare stikstof. Bewaar de bevroren virale voorraden in een vrieskist van -80 °C. Voer lentivirus-gemedieerde transductie van de blaastumor organoïden. Op dag 2 splitste u de hierboven beschreven tumororganoïden (stap 1.2) 12 uur vóór de lentivirus-gemedieerde transductie. Ontdooi op dag 3 snel een aliquot (stap 2.1.9) met virus in een waterbad van 37 °C en voeg de 250 μL organoïde medium toe met 10 μM Y-27632 en 8 μg/mL hexadimethrine bromide. Vervang het organoïde medium in de 24-putplaat door tumororganoïden door 500 μL virushoudend medium en incubeer gedurende 12-16 uur in een couveuse (37 °C, 5% CO2). Op dag 4 wijzig je het medium met 500 μL vers organoïde medium.OPMERKING: Na 12-16 uur incubatie moet het medium worden vervangen, omdat het medium dat lentivirus en hexadimethrine bromide bevat, cytotoxisch is. Monitor op dag 6 het GFP-signaal van de tumororganoïden 3 dagen na transductie onder een fluorescentiemicroscoop (figuur 2B). Op dag 10, passage en voorraad van de organoïden 7 dagen na transductie zoals beschreven in stap 1.2, om de genetisch gemodificeerde tumor organoïde lijnen te handhaven. 3. Orthotopische transplantatie van blaasorganoïde(figuur 3A) Bereid de blaastumor organoïden voor orthotopische transplantatie. Voor transplantatie kweekt de blaastumororganoïden gedurende 5-7 dagen, zoals hierboven beschreven (stap 1.2). Voeg 500 μL collageenase/dispase toe aan organoïde medium in een 24-putplaat met de tumororganoïden. Pipetteer op en neer de kelder membraan matrix en medium. Incubeer gedurende 20 min bij 37 °C en verzamel de cellen in een buis van 15 mL. Voeg 5 mL voorverwarmde DMEM toe, centrifugeer de buis op 400 x g gedurende 3 min bij 4 °C en zuig de supernatant aan. Zet de pellet opnieuw op met 1 mL DMEM en breng de oplossing over in een petrischaal van 90 mm. Onder een microscoop, pick-up van de 10-100 tumor organoïden met behulp van een p200 micropipette en verzamel ze in een microtube op ijs. Centrifugeer de buis op 400 x g gedurende 3 min bij 4 °C en gooi de supernatant voorzichtig weg. Onderhoud de celpellet op ijs totdat de muizen klaar zijn voor een operatie. Submucosale blaaswandtransplantatieOPMERKING: Deze procedure wordt gewijzigd uit het protocol gepubliceerd door Fu etal. 18. Bereid een 8 tot 10 week oude mannelijke naakt muis (CAnN.Cg-Foxn1nu / Crl) ten minste 1 week voor het experiment om het mogelijk te maken om te acclimatiseren aan een nieuwe omgeving. Injecteer enrofloxacine (5 mg/kg) onderhuids 24 uur voor de operatie. Maak het bankoppervlak schoon door zeep en water. Autoclave de chirurgische instrumenten voorafgaand aan de chirurgische ingreep en het uitvoeren van een operatie met behulp van steriele instrumenten. Houd de 29 G insulinespuit, pipettips en keldermembraanmatrix op ijs. Toedienen ketoprofen (5 mg/kg) onderhuids vóór toediening van anesthesie. Verdoven de muis met 4% isoflurane in een inductiekamer. Zodra de algemene anesthesie bereikt, leg de muis in een supine positie en handhaven anesthesie door masker inademing van 2% verdampte isoflurane.OPMERKING: Als de verdovingstijd meer dan 30 min is, breng dan oogzalf aan op beide ogen met behulp van een wattenstaafje om hoornvliesdrogen te voorkomen. Breng povidone-jodium aan met een steriel gaas en veeg het af met 70% ethanol. Herhaal 3x met een nieuw gaas of een wattenstaafje elke keer. Bedek de anus en het chirurgische veld met behulp van wegwerp, steriele chirurgische gordijnen. Met behulp van een ontledenmicroscoop voor vergroting, maak een kleine transversale incisie (kleiner dan 1,5 cm) in de huid en gespierde wand van de onderste middellijn buik met steriele chirurgische schaar. Stel de blaas uit de buikholte bloot en steun deze met zoutgedrenkswatten.OPMERKING: Als de blaas vol urine zit, druk dan voorzichtig op de blaas om deze iets te decomprimeren. Resuspend de organoïde pellets (stap 3.1.7) in 80 μL organoïde medium met 50% hoge concentratie keldermembraanmatrix(Tafel van Materialen). Injecteer de organoïde suspensie in het voorste aspect van de blaaskoepel met behulp van de 29 G insulinespuit onder een ontledende microscoop. Sluit de binnenste laag van de buikwand met antibacteriële absorberende hechting en sluit de buitenste laag met 4-0 nylon hechting. Desinfecteer de chirurgische site met povidone-jodium en 70% ethanol. Laat de muis herstellen onder een infrarood irradiator 10-15 min. Monitor de muis totdat hij weer bij bewustzijn en beweeglijkheid. Controleer een dag na de operatie de algemene toestand van de muis en anastomotische lekkage. Beheer ketoprofen (5 mg/kg) eenmaal daags per dag gedurende 3 dagen postoperatief en behandel enrofloxacine (5 mg/kg) eenmaal per dag gedurende 10 dagen postoperatief. Wanneer incisie plaats is genezen (10-14 dagen na de operatie), verwijder de hechtingen. Monitor de groei van de muisblaastumor gedurende 2-3 weken na de tumor organoïde injectie. Als de groei van de blaastumor wordt waargenomen, euthanaseren de muis met behulp van kooldioxide inademing, en oogst de hele blaastumor. Was het met koude DPBS (figuur 3B)16. Om de blaastumor histologie te analyseren, vlek de paraffine-ingebedde sectie van het weefsel met behulp van hematoxyline en eosine (H en E) kleuring(figuur 3B)16.