Интегрированная Рамана спектроскопия и массовая спектрометрия Платформа для изучения одноклеточного потребления наркотиков, метаболизма и эффектов

1. Культура клеток Культурные ячейки, представляющие интерес в соответствующих культурных средствах массовой информации. Пенициллин-стрептомицин может быть добавлен, чтобы избежать загрязнения. В случае клеток HepG2, культурные клетки в культурном носителе, содержащем модифицированную среду Орла (DMEM) Dulbecco, дополнены 10% сывороткой крупного рогатого скота плода (FBS) и 0,1% пенициллина-стрептомицина. Для того чтобы faciltate измерения спектроскопии Raman, клетки можно вырастить на 0.1% gelatin-coated стеклянн-дно тарелку или слайды кварца. Инкубировать клетки в течение 2 дней при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 в увлажненный инкубатор. Синхронизация клеточных культур для достижения 70% стоек. Клетки субкультуры в 35 мм стеклянно-нижней сетки блюдо или кварцевые слайды с использованием той же среде при плотности посева 0,7 х 106, а затем инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 24 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: Культура блюда или слайды могут быть предварительно покрыты коллагена или желатина покрытие решение с соотношением поверхности культуры 5 мкг / см2, чтобы позволить им исправить, обеспечивая их выживание во время измерения. 2. Лечение наркомании Удалить клеточные культуры из инкубатора и вымыть 2x с предварительно разогретым буфером PBS (37 градусов по Цельсию).ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимально удалить клетки для медикаментозного лечения при стыке 50%-60%. Разделите клетки на медикаментозные и необработанные подгруппы в 35-мм культурных блюдах. Смешайте препарат выбора с культурой средств массовой информации. Например, растворить тамоксифен в диметилсульфодоксид (DMSO) и смешать с культурой средств массовой информации для получения окончательного объема 2 мл и тамоксифен концентрации 10 мкм. Это будет группа, лечимую наркотиками. Смешайте соответствующий объем растворителя (DMSO) в среду в качестве контроля для изучения влияния DMSO. Это будет контрольная группа. Инкубировать обе группы в 2 мл шипами средств массовой информации подготовлены в шагах 2,3-2,4 на 24 ч. Ожидаемая стоя после инкубации должна состочиться 70%-80%. 3. Раман спектральной визуализации и спектральной обработки ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя Раман спектроскопии системы коммерчески доступны, Раман спектроскопии системы, используемой здесь является самодельным линии сканирования конфокальный микроскоп ранее описано7,8. Вкратце, эта система оснащена 532 нм диод накачкой твердотельного лазера. Лазерный свет формируется в плоскости с помощью цилиндрической линзы, которая позволяет измерения 400 спектров в одной экспозиции. Раман спектры были записаны с помощью охлажденных CCD камеры, установленной на полихроматор, который использует 1200 канавки / мм решетки для максимизации спектрального разрешения области отпечатков пальцев (от 500-1,800 см-1). Эта спектральная область содержит высокую плотность частот, характерных для молекул, которые генерируют рассеяние Раман. Также используется объектив для погружения в воду (NA No 0.95). Пространственное разрешение этой системы составляет 300 нм, а спектральное разрешение – 1 см-1. Для обеспечения выживания клеток в ходе эксперимента используется микрокамерка, закрепленная на моторизованной стадии микроскопа. Перед спектральными измерениями проверьте выравнивание оптики. 50 мкм пинхол может быть использован для проверки того, что пинхол и лазерное положение совпадают точно. Введите спектрофотометр щели, когда сужение как можно больше. Используйте этанол для калибровки спектрофотометра перед каждым экспериментом. Чтобы сделать это, поместите EtOH в стеклянное дно блюдо, измерить спектр при данной интенсивности лазера (измеряется в образце) в течение 1 с, и связать пик известных длин волн7. Свести к минимуму интенсивность лазера в образце до 2,4 мВт/м2, чтобы клетки выжили при воздействии лазера. Настройка микрокамеры на 5% CO2 и 37 градусов по Цельсию. Как только система микроскопа готова, удалите клетки из инкубатора и немедленно промыть клетки 2x с разогретым PBS (37 градусов по Цельсию) буфер, а затем добавить 2 мл разогретого PBS (37 градусов по Цельсию) или DMEM, чтобы повторно приостановить клетки.ПРИМЕЧАНИЕ: Как PBS, так и FluoroBrite DMEM-медиа являются достаточными вариантами для измерений спектроскопии Рамана, поскольку они производят минимальный фоновый сигнал. Добавьте 10 кл воды на объектив объективного погружения в воду и деликатно поместите стеклянно-нижнюю клеточное блюдо на сцену микроскопа. Измерьте каждую ячейку, сосредоточив лазерную линию. Время выдержки 15 s в клетку достаточно здесь для того чтобы получить поперечное сечение клетки с ясным сигналом Raman. Зеркало гальвано позволяет сканировать одну клетку или группу клеток в течение нескольких десятков минут.ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокое разрешение полной спектральной визуализации клеток требует больше времени и может привести к фотоповреждению. Здесь клетки измерялись с помощью однолинейного воздействия для получения поперечного сечения каждой клетки. Такой подход является хорошим компромиссом для увеличения пропускной способности и получения достаточной информации для дискриминации ячеек, а также обеспечения жизнеспособности клеток путем ограничения фотоповреждения. 4. Предварительная обработка спектральных данных и многовариантный анализ ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительная обработка является необходимым шагом до дополнительного анализа для того, чтобы удалить нежелательные технические изменения в спектральных данных. Из-за разнообразия методов и программного обеспечения, исчерпывающий список не может быть предоставлена, и Есть много полезных обзоров, найденных в литературе7,8. В этом разделе мы кратко описываем подход, используемый для анализа и интерпретации спектральных данных Раман, полученных из живых одиночных клеток. Извлекайте и предварительно обрабатывают изображения Раман для удаления возможных помех космических лучей.ПРИМЕЧАНИЕ: Спектральная ось спектра, полученных в разные дни/недели/месяцы, может включать некоторые вариации из-за небольших технических вариаций при калибровке с использованием этанола. Это сильно повлияет на последующие многовариантные анализы и статистические сопоставления. В случае, если эксперименты проводятся в течение различных недель/месяцев, ожидаются небольшие оптические вариации. В этом случае данные должны быть интерполированы для исправления возможных спектральных сдвигов данных в экспериментах. Здесь используется интерполяция с использованием кубического сплайна. После этого шага вся ось спектра должна быть выровнена. Для последующего анализа рассматривается диапазон 500-1800 см-1. Извлекайте спектральные данные клеток и фона (отсутствие клеток) из каждого изображения с помощью домашнего алгоритма. Вычесть фоновый сигнал из сигнала ячейки. Затем усреднените спектры оставшихся пикселей, которые должны соответствовать одной ячейке. Следующие шаги выполняются с использованием 2D спектров клеток. Выполните базовую коррекцию с помощью ModPoly9 или любого другого алгоритма, который, по ее оценкам, соответствует достаточно. Обрезать спектральный диапазон до 600-1700 см-1, чтобы выбрать область отпечатков пальцев и убедитесь, что нет нежелательных эффектов края на спектры из-за плохой полиномиальной установки. Выполните шаг нормализации, такой как нормализация вектора (интенсивность на каждой волновой численности делится на глобальную норму l2 или максимальное сингулярное значение спектра) для нормализации спектральной интенсивности10,хотя можно считать и другие нормализации. Подготовьте набор данных с соответствующей меткой для каждого класса/условия.ПРИМЕЧАНИЕ: Сравнительный спектральный анализ может быть perfored для изучения характера возможных различий между классом клеток / условиями (например, путем вычитания среднего спектра контрольной группы другим группам для выявления регионов, представляющих интерес (таких как потенциальные биомаркеры). Расчеты баллов ANOVA и Fisher также могут бытьвыполнены 10. Для выявления обработанных и необработанных клеток на основе спектральных особенностей можно применять многовариантные анализы. В качестве набора обучаемых данных следует использовать нормализованные спектральные данные, а неизвестный набор данных (без метки) из эксперимента репликации следует использовать в качестве тестовых данных, если это возможно.ПРИМЕЧАНИЕ: Дискриминационный анализ, выполненный на некоторых векторах анализа основных компонентов (PCA-DA10),проекция на скрытые оценки с последующим дискриминационным анализом (PLS-DA), и машины поддержки векторных (SVM)11 являются моделями, часто используемыми в этой области, и каждая из них представляет различные статистические соображения. Предварительная обработка данных должна быть выполнена в связи с этим. Используйте машинное обучение, которое соответствует экспериментальным целям. Здесь проекция на спотовую структуру (PLS) модель построена с использованием спектральной области отпечатков пальцев Раман спектры (600-1,710 см-1)11,12. Средний центр данных по мере необходимости. Для перекрестной проверки модели могут применяться различные методы.ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь применяется венецианская слепая перекрестная проверка с 10 сплитами. Сложность модели (количество компонентов или спотовая переменная) должна быть проверена таким образом, чтобы лучшая модель минимизировать значение исходной средней квадратной ошибки (RMSE). Было установлено, что три скрытых вектора (LVs) обеспечивают наилучшую дискриминацию с нашим набором данных. Определите, какие спектральные пики Раман способствуют дискриминации клеток (например, путем построения оценки переменной важности в проекции (VIP) для каждого волнового числа Раман или величины коэффициента регрессии).ПРИМЕЧАНИЕ: VIP-оценка переменной рассчитывается как взвешенная сумма квадратной корреляции между компонентами PLS-DA и исходной переменной. Подробную информацию об алгоритме PLS и VIP баллов можно найти в литературе11,12. 5. Одноклеточная настройка выборки и процедуры Исправить систему выборки клеток на рамановый микроскоп, как показано на рисунке 1. Подключите 3D-мипулипулитор к стеклянному держателю капилляра, который крепится к пустому шприцу для сосания образца, применяя отрицательное давление(рисунок 1). Установите микроскоп на поле высокого увеличения (40x), чтобы наблюдать за кончиком стеклянного капилляра и убедиться, что он не сломан. Контролируйте положение стеклянного капилляра с помощью микроманипулятора (x-, y-, z-axes). Убедитесь, что капиллярный наконечник по центру в поле зрения, а затем переместить капилляр вверх по оси z, чтобы дать клиренс для культуры блюдо позже.ПРИМЕЧАНИЕ: Микроотбор клеток выполняется стеклянным капилляром для клеток диаметром от 10-15 мкм. Рекомендуется капилляр с отверстием размером 5 мкм. Если размер скважины слишком мал, кончик капилляра будет подключен к клетке, и если он слишком велик, чувствительность более поздних измерений MS может быть скомпрометирована. Поместите образец пластины / блюдо на стадии микроскопа, настроить увеличение и фокус, выбрать целевую ячейку на сетке блюдо, и переместить его в центр зрения. Затем осторожно опустите стеклянный капилляр с помощью микроманипулятора (z-оси) до тех пор, пока кончик не вступит в фокус.ПРИМЕЧАНИЕ: Не двигайте капиллярв в x- и y-axes до тех пор пока капилляр не будет в фокусе. Под микроскопическим наблюдением коснитесь целевую одну ячейку с капиллярным наконечником, а затем начните применять отрицательное давление с помощью шприца, чтобы поймать клетку внутри капиллярного наконечника. Запишите эту процедуру, взяв фото или видео, чтобы проверить время и всасывается расположение ячейки точно, если это необходимо. Переместите капилляр на оси z. Затем отсоедините капилляр от капиллярного держателя с помощью щипц в рамках подготовки к анализу MS. 6. Измерения масс-спектрометрии Калибровать точность массы прибора MS в соответствии с рекомендациями производителя. После калибровки убедитесь, что массовая ошибка не превышает 3 промилле. Оптимизируйте инструмент MS до параметров, которые лучше всего подходят для поиска интересов.ПРИМЕЧАНИЕ: В случае тамоксифена и 4-OHT анализа, параметры прибора установлены следующим образом: температура капилляра впуска: 400 градусов по Цельсию, напряжение спрея: 1500 В, автоматическая цель усиления (AGC): 5.00E-06, уровень S-объектива RF: 90%, диапазон SIM: 347-397 м/з, SIM максимальное время впрыска: 200 мс, разрешение SIM: 140 000 FWHM, диапазон MS/MS: 50-400 м/z, цель MS/MS AGC: 2.00E-05, MS/MS максимальное время впрыска: 100 мс, MS/MS разрешение: 17,500 FWHM, MS/MS изоляция: 1 м/з. Настройте автоматический метод приобретения с продолжительностью 5 минут для SIM-режима для достижения относительной количественной оценки, а другой метод MS/MS для положительной идентификации препарата и его метаболита. Параметры метода приобретения должны быть установлены на оптимизированные значения, упомянутые в шаге 6.2. Подготовьте растворитель ионизации под капотом дыма. Состав растворителя зависит от прогноза интереса. Здесь используемый органический растворитель состоит из 80% MeOH, 10% DMSO и 0,1% для метакислоты. До начала измерений смешайте соответствующий внутренний стандарт с органическим растворителем. В этом эксперименте в качестве внутреннего стандарта используется 5,31 нМ d5-тамоксифена. Чтобы избежать ложных срабатываний, аспирировать средства массовой информации, окружающие клетки, обработанные препаратом с помощью 1 мкм отверстие размера капилляра с постоянным микроскопическим наблюдением, чтобы избежать отбора проб любых клеточных частей. Добавьте 2 злитролога растворителя ионизации к широкому концу капилляра, содержащего носитель, используя пипетку, прикрепленную к наконечникам погрузчика. Затем проанализируйте отобранные носители по MS, проверьте наличие анализа интереса (обычно его не следует обнаруживать). Добавьте 2 Зл растворителя ионизации в капилляр, содержащий клетку, зафиксируйте капилляр ный адаптер наноэлектроспрепа (nano-ESI), подключенный к подходящему масс-спектрометру, и начните автоматический метод приобретения. 7. Обработка и анализ данных масс-спектрометрии ПРИМЕЧАНИЕ: Любое подходящее программное обеспечение может быть использовано для выполнения анализа данных. Однако, если исследователи хотят провести анализ данных с помощью программного обеспечения, которое не предоставляется поставщиком MS, то исходные данные должны быть преобразованы из формата запатентованного поставщика в открытый формат или в качестве текстового файла в первую очередь (что было сделано здесь). Нормализовать данные путем деления пиковой области анализа интереса (ы) на внутренний стандарт от того же сканирования MS. Затем журнал преобразует пиковые соотношения, чтобы уменьшить перекос. Участок нормализованной интенсивности препарата или его метаболита, как квадратный участок или кривой плотности, чтобы визуализировать распределение между одиночными клетками. Здесь используется программное обеспечение R, а также пакет ggplot2. Рассчитайте метаболизированный препарат до неметаболизированного лекарственного соотношения, разделив обилие метаболита препарата на неметаболизированную родительскую молекулу в каждой клетке (т.е. 4-OHT и тамоксифен, соответственно.ПРИМЕЧАНИЕ: Корреляция между вариациями конкретных пиков Раман интерес и вариации в MS пики препарата или его метаболитов могут быть изучены. Это дополнение к возможной корреляции между самим препаратом и его метаболитом в одиночных клетках. Это можно сделать путем расчета коэффициента корреляции Пирсона с помощью двуххвостого теста. Следует также рассмотреть более продвинутые интеграционные подходы.