Une plate-forme intégrée de spectroscopie et de spectrométrie de masse Raman pour étudier l'apport, le métabolisme et les effets des médicaments à une seule cellule

1. Culture cellulaire Cellules de culture d’intérêt dans un média culturel approprié. La pénicilline-streptomycine peut être ajoutée pour éviter la contamination. Dans le cas des cellules HepG2, cellules de culture dans un milieu de culture contenant le milieu modifié de l’aigle de Dulbecco (DMEM) complété avec 10% de sérum bovin foetal (FBS) et 0,1% pénicilline-streptomycine. Pour faciliter les mesures de spectroscopie Raman, les cellules peuvent être cultivées sur un plat à fond de verre enduit de gélatine de 0,1 % ou des lames de quartz. Incuber les cellules pendant 2 jours à 37 oC et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié. Synchroniser les cultures cellulaires pour atteindre 70% de confluence. Les cellules de sous-culture dans un plat de grille de 35 mm à fond de verre ou des glissières de quartz utilisant le même milieu à une densité d’ensemencement de 0,7 x 106, puis incuber à 37 oC pendant 24 h.REMARQUE : Les plats ou les lames de culture peuvent être pré-enduits avec la solution de revêtement de collagène ou de gélatine avec un rapport de surface de culture de 5 ug/cm2 pour leur permettre de fixer, assurant leur survie pendant la mesure. 2. Traitement médicamenteux Retirez les cultures cellulaires de l’incubateur et lavez 2x avec un tampon PBS préchauffé (37 oC).REMARQUE: Il est optimal d’enlever les cellules pour le traitement médicamenteux à une confluence de 50%-60%. Divisez les cellules en sous-groupes traités par des médicaments et non traités dans des plats de culture de 35 mm. Mélangez la drogue de choix avec les médias culturels. Par exemple, dissoudre le tamoxifène dans le sulfoxide de diméthyle (DMSO) et mélanger avec le support culturel pour obtenir un volume final de 2 ml et une concentration de tamoxifène de 10 M. Ce sera le groupe traité par la drogue. Mélanger un volume correspondant de solvant (DMSO) dans le milieu comme un contrôle pour étudier les effets de DMSO. Ce sera le groupe témoin. Incuber les deux groupes dans 2 ml des supports à pointes préparés en étapes 2.3-2.4 pour 24 h. La confluence attendue après l’incubation devrait être de 70%-80%. 3. Imagerie spectrale Raman et traitement spectral REMARQUE : Bien que les systèmes de spectroscopie de Raman soient disponibles dans le commerce, le système de spectroscopie Raman utilisé ici est un microscope confocal de balayage de ligne construit à la maison précédemment décrit7,8. En bref, ce système est équipé d’une diode de 532 nm pompé laser à l’état solide. La lumière laser est formée en un plan à l’aide d’une lentille cylindrique, ce qui permet de mesurer 400 spectres en une seule exposition. Les spectres Raman ont été enregistrés à l’aide d’une caméra CCD refroidie montée sur un polychromator qui utilise un grating de 1 200 rainures/mm pour maximiser la résolution spectrale de la région d’empreintes digitales (de 500 à 1 800 cm-1). Cette zone spectrale contient une forte densité de fréquences spécifiques aux molécules qui génèrent la diffusion de Raman. Une lentille d’immersion de l’eau (NA 0,95) est également utilisée. La résolution spatiale de ce système est de 300 nm et la résolution spectrale est de 1 cm-1. Pour assurer la survie des cellules pendant l’expérience, une microchambre fixée sur un stade de microscope motorisé est utilisée. Avant les mesures spectrales, vérifiez l’alignement de l’optique. Un trou d’épingle de 50 m peut être utilisé pour vérifier que le trou d’épingle et la position laser correspondent exactement. Entrez dans la pari du spectrophotomètre lorsqu’il est rétréci autant que possible. Utilisez de l’éthanol pour calibrer le spectrophotomètre avant chaque expérience. Pour ce faire, placez EtOH dans un plat à fond de verre, mesurez le spectre à une intensité laser donnée (mesurée à l’échantillon) pendant 1 s, et associez le pic aux longueurs d’onde connues7. Réduire au minimum l’intensité laser de l’échantillon à 2,4 mW/m2 afin que les cellules survivent à l’exposition au laser. Installer la microchambre à 5% de CO2 et 37 oC. Une fois que le système de microscope est prêt, retirer les cellules de l’incubateur et rincer immédiatement les cellules 2x avec un tampon PBS réchauffé (37 oC), puis ajouter 2 ml de PBS réchauffé (37 oC) ou DMEM pour resuspendre les cellules.NOTES: Les médias PBS et FluoroBrite DMEM sont des options suffisantes pour les mesures de spectroscopie Raman parce qu’ils produisent un signal de fond minimal. Ajouter 10 l’eau sur la lentille objective d’immersion en eau et placer délicatement le plat à cellules à fond de verre sur le stade du microscope. Mesurez chaque cellule en concentrant la ligne laser. Un temps d’exposition de 15 s par cellule est suffisant ici pour obtenir une section transversale d’une cellule avec un signal clair de Raman. Un miroir de galvano permet la numérisation d’une cellule ou d’un groupe de cellules en quelques dizaines de minutes.NOTES: Une résolution plus élevée de l’imagerie spectrale complète des cellules nécessite plus de temps et peut conduire à photodamage. Ici, les cellules ont été mesurées à l’aide d’une exposition à une seule ligne pour obtenir une section transversale de chaque cellule. Cette approche est un bon compromis pour augmenter le débit et obtenir suffisamment d’informations pour discriminer les cellules, tout en assurant la viabilité des cellules en limitant les photodommages. 4. Prétraitement des données spectrales et analyses multivariées REMARQUE : Le prétraitement est une étape nécessaire avant une analyse supplémentaire afin d’éliminer les variations techniques indésirables dans les données spectrales. En raison de la diversité des méthodes et des logiciels, une liste exhaustive ne peut pas être fournie, et il ya beaucoup d’examens utiles trouvés dans la littérature7,8. Dans cette section, nous décrivons brièvement l’approche utilisée pour analyser et interpréter les données spectrales de Raman obtenues à partir de cellules individuelles vivantes. Extraire et prétraiter les images raman pour éliminer les interférences possibles des rayons cosmiques.REMARQUE : L’axe spectral des spectres obtenus au cours de différents jours/semaines/mois peut inclure certaines variations dues à de petites variations techniques lors de l’étalonnage à l’aide d’éthanol. Cela aura un impact important sur les analyses multivariées et les comparaisons statistiques ultérieures. Dans le cas où des expériences sont effectuées au cours de différentes semaines/mois, de petites variations optiques sont attendues. Dans ce cas, les données doivent être interpolées pour corriger les déplacements spectrals éventuels des données à travers les expériences. Interpolation à l’aide de spline cubique est utilisée ici. Après cette étape, tous les axes spectrals doivent être alignés. Une plage de 500-1800 cm-1 est considérée pour l’analyse ultérieure. Extraire les données spectrales des cellules et de l’arrière-plan (absence de cellules) de chaque image à l’aide d’un algorithme fait maison. Soustrayez le signal d’arrière-plan du signal de la cellule. Ensuite, moyenne des spectres des pixels restants, ce qui devrait correspondre à une seule cellule. Les étapes suivantes sont effectuées à l’aide des spectres 2D des cellules. Effectuer une correction de base à l’aide du ModPoly9 ou de tout autre algorithme qu’il a estimé pour s’adapter suffisamment. Coupez la plage spectrale à 600-1700 cm-1 pour sélectionner la région d’empreinte digitale et s’assurer qu’il n’y a pas d’effets de bord indésirables sur les spectres en raison d’un mauvais ajustement polynomial. Effectuer une étape de normalisation telle que la normalisation des vecteurs (l’intensité à chaque nombre d’ondes est divisée par la norme globale l2 ou la valeur unique maximale d’un spectre) pour normaliser l’intensité spectrale10, bien que d’autres normalisations puissent être envisagées. Préparer un jeu de données avec l’étiquette appropriée pour chaque classe/condition.REMARQUE : Des analyses spectrales comparatives peuvent être effectuées pour explorer la nature des différences possibles entre les classes/conditions cellulaires (p. ex., en soustrayant le spectre moyen du groupe témoin à d’autres groupes afin d’identifier les régions d’intérêt [comme les biomarqueurs potentiels]). Les calculs des scores ANOVA et Fisher peuvent également être effectués10. Pour identifier les cellules traitées et non traitées en fonction des caractéristiques spectrales, des analyses multivariées peuvent être appliquées. Une donnée spectrale normalisée doit être utilisée comme ensemble de données de formation, et un jeu de données inconnu (sans étiquette) d’une expérience de repli devrait être utilisé comme données de test, si possible.REMARQUE : Analyse discriminante effectuée sur un vecteur d’une analyse principale des composants (PCA-DA10),projection sur des scores latents suivi d’une analyse discriminante (PLS-DA), et les machines vectorielles de soutien (SVM)11 sont des modèles souvent utilisés sur le terrain, et chacun présente des considérations statistiques différentes. Le prétraitement des données doit être effectué par conséquent. Utilisez l’apprentissage automatique qui correspond aux objectifs expérimentaux. Ici, une projection sur la structure latente (PLS) modèle est construit en utilisant la région d’empreintes spectrales de Spectres Raman (600-1,710 cm-1)11,12. Centre zona les données au besoin. Pour la validation croisée du modèle, différentes techniques peuvent être appliquées.REMARQUE: Ici, une validation croisée vénitienne aveugle avec 10 fractionnements est appliquée. La complexité du modèle (nombre de composants ou variable latente) doit être testée afin que le meilleur modèle minimise la valeur de l’erreur carrée moyenne racine (RMSE). Il a été constaté que trois vecteurs latents (LV) fournissaient la meilleure discrimination avec notre jeu de données. Identifier les pics spectrals Raman qui contribuent à la discrimination des cellules (p. ex., en traçant le score d’importance variable dans la projection [VIP] pour chaque nombre d’ondes Raman ou l’ampleur du coefficient de régression).NOTES: Le score VIP d’une variable est calculé comme une somme pondérée des corrélations au carré entre les composants PLS-DA et la variable d’origine. Les détails concernant PLS et l’algorithme de scores VIP peuvent être trouvés dans la littérature11,12. 5. Configuration et procédures d’échantillonnage à cellule unique Fixer le système d’échantillonnage cellulaire sur le microscope Raman comme le montre la figure 1. Connectez le micromanipulateur 3D au support capillaire en verre qui est attaché à une seringue vide pour aspirer l’échantillon en appliquant une pression négative (Figure 1). Mettre le microscope sur un champ de grossissement élevé (40x) pour observer la pointe du capillaire en verre et s’assurer qu’il n’est pas cassé. Contrôlez la position du capillaire en verre à l’aide du micromanipulateur (x-, y-, z-axes). Assurez-vous que la pointe capillaire est centrée dans le champ de vision, puis déplacez le capillaire vers le haut sur l’axe z pour donner l’autorisation pour le plat de culture plus tard.REMARQUE : Le microéchantillonnage des cellules est effectué par le capillaire en verre pour les cellules de diamètre s’établissant entre 10 et 15 m. Il est recommandé d’avoir un capillaire d’une taille d’alésage de 5 millions d’euros. Si la taille de l’alésage est trop petite, la pointe capillaire sera obstruée par la cellule, et si elle est trop grande, la sensibilité des mesures ultérieures de la SP peut être compromise. Placez la plaque d’échantillon/plat sur la scène du microscope, ajustez le grossissement et concentrez-vous, sélectionnez la cellule cible sur le plat de grille, et déplacez-la dans le centre de vue. Ensuite, abaissez soigneusement le capillaire en verre à l’aide d’un micromanipulateur (axe Z) jusqu’à ce que la pointe soit mise au point.REMARQUE: Assurez-vous de ne pas déplacer le capillaire dans les x- et y-axes jusqu’à ce que le capillaire est au point. Sous observation microscopique, touchez la cellule unique cible avec la pointe capillaire, puis commencez à appliquer une pression négative à l’aide de la seringue pour piéger la cellule à l’intérieur de la pointe capillaire. Enregistrez cette procédure en prenant une photo ou une vidéo pour vérifier le moment et l’emplacement aspiré de la cellule avec précision, si nécessaire. Déplacez le capillaire vers le haut sur l’axe z. Ensuite, détachez le capillaire du support capillaire à l’aide de forceps en préparation à l’analyse de la SP. 6. Mesures de spectrométrie de masse Calibrer la précision de masse de l’instrument MS selon les recommandations du fabricant. Après l’étalonnage, assurez-vous que l’erreur de masse n’est pas supérieure à 3 ppm. Optimisez l’instrument MS aux paramètres qui conviennent le mieux à l’analyte d’intérêt.REMARQUE : Dans le cas du tamoxifène et de l’analyse 4-OHT, les paramètres de l’instrument sont réglés sur les paramètres suivants : température capillaire d’entrée : 400 oC, tension de pulvérisation : 1500 V, objectif de contrôle automatique des gains (AGC) : 5,00E-06, niveau RF S-lentille : 90 %, gamme SIM : 347-397 m/z, temps d’injection maximum SIM : 200 ms, résolution SIM : 140 000 FWHM, FWHM, Gamme MS/MS: 50-400 m/z, Cible MS/MS AGC: 2.00E-05, MS/MS temps d’injection maximum: 100 ms, résolution MS/MS: 17.500 FWHM, Fenêtre d’isolement MS/MS: 1 m/z, MS/MS normalized collision energy (NCE): 35. Mettre en place une méthode d’acquisition automatique d’une durée de 5 minutes pour le mode SIM afin d’atteindre une quantitation relative, et une autre méthode de SP/MS pour l’identification positive du médicament et de son métabolite. Les paramètres de la méthode d’acquisition doivent être réglés sur les valeurs optimisées mentionnées à l’étape 6.2. Préparer le solvant d’ionisation sous une hotte de fumée. La composition du solvant dépend de l’analyte d’intérêt. Ici, le solvant organique utilisé se compose de 80% MeOH, 10% DMSO, et 0,1% d’acide formique. Mélanger une norme interne appropriée avec le solvant organique avant les mesures. Dans cette expérience, 5,31 nM de d5-tamoxifène est utilisé comme norme interne. Pour éviter les faux positifs, aspirez les médias entourant les cellules traitées avec le médicament à l’aide d’un capillaire de taille aléa de 1 m d’aperçage avec une observation microscopique constante pour éviter d’échantillonner des pièces cellulaires. Ajouter 2 ll du solvant d’ionisation à l’extrémité large du capillaire contenant le support à l’aide d’une pipette attachée aux pointes du chargeur. Ensuite, analysez les médias échantillonnés par MS, vérifiez la présence de l’analyte d’intérêt (normalement, il ne devrait pas être détectable). Ajoutez 2 L le solvant d’ionisation au capillaire contenant la cellule, fixez le capillaire à un adaptateur de nanoélectrospray (nano-ESI) relié à un spectromètre de masse approprié, et commencez la méthode d’acquisition automatique. 7. Traitement et analyse de données de spectrométrie de masse REMARQUE : Tout logiciel approprié peut être utilisé pour effectuer l’analyse des données. Toutefois, si les chercheurs souhaitent effectuer une analyse de données à l’aide d’un logiciel qui n’est pas fourni par le fournisseur de SP, les données brutes doivent être converties du format fournisseur propriétaire à un format ouvert ou en tant que fichier texte en premier (ce qui a été fait ici). Normaliser les données en divisant la zone de pointe de l’analyte d’intérêt par celle de la norme interne à partir de la même analyse de la SP. Ensuite, le journal transforme les ratios de pointe pour réduire l’inclinaison. Tracer l’intensité normalisée du médicament ou de son métabolite comme une courbe de parcelle de terrain ou de densité pour visualiser la distribution entre les cellules individuelles. Ici, le logiciel statistique R est utilisé, avec le paquet ggplot2. Calculer le médicament métabolisé au rapport de drogue non métabolisé en divisant l’abondance du métabolite de drogue par celui de la molécule parente non métabolisée dans chaque cellule (c.-à-d., 4-OHT et tamoxifène, respectivement.REMARQUE : La corrélation entre les variations des pics d’intérêt spécifiques de Raman et les variations des pics de SP du médicament ou de ses métabolites peut être étudiée. Il s’agit d’un ajout à la corrélation possible entre le médicament lui-même et son métabolite dans les cellules individuelles. Cela peut être fait en calculant le coefficient de corrélation Pearson à l’aide d’un test à deux queues. Des approches intégratives plus avancées devraient également être envisagées.