Een geïntegreerde Raman-spectroscopie en massaspectrometrie platform voor het bestuderen van de opname van één cel drug, metabolisme, en effecten

1. celcultuur Cultuur cellen van belang in een geschikte cultuur media. Penicillaire-streptomycine kan worden toegevoegd om besmetting te voorkomen. In het geval van HepG2 cellen, cultuur cellen in een cultuur media met Dulbecco’s gemodificeerde Eagle’s medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 0,1% penicillaire-streptomycine. Voor de metingen van de Raman-spectroscopie kunnen cellen worden geteeld op een 0,1% Gelatin-gecoate glazen bodem schotel of kwarts platen. Incuberen cellen gedurende 2 dagen bij 37 °C en 5% CO2 in een bevoficeerde incubator. Synchroniseer celculturen om 70% confluency te bereiken. Subcultuurcellen in een 35 mm glasbodem schotel of kwarts dia’s met behulp van hetzelfde medium bij een zaaien dichtheid van 0,7 x 106, vervolgens inbroed bij 37 °c gedurende 24 uur.Let op: Cultuur gerechten of glijbanen kunnen vooraf worden gecoat met een collageen-of gelatine coating oplossing met een cultuur oppervlak ratio van 5 UG/cm2 om ze te laten repareren, zodat ze kunnen overleven tijdens het meten. 2. medicamenteuze behandeling Verwijder celculturen uit de incubator en was 2x met voorverwarmde PBS-buffer (37 °C).Opmerking: het is optimaal om cellen te verwijderen voor medicamenteuze behandeling met een confluentie van 50%-60%. Verdeel cellen in drugs behandelde en onbehandelde subgroepen in 35 mm cultuur gerechten. Meng het medicijn naar keuze met de cultuur media. Los bijvoorbeeld Tamoxifen op in dimethylsulfoxide (DMSO) en meng met de kweekmedia om een eindvolume van 2 mL en Tamoxifen-concentratie van 10 μM te verkrijgen. Dit wordt de met drugs behandelde groep. Meng een overeenkomend volume oplosmiddel (DMSO) in het medium als een controle om de effecten van DMSO te bestuderen. Dit wordt de controlegroep. Inincuberen beide groepen in 2 mL van de spiked media bereid in stappen 2.3-2.4 voor 24 h. De verwachte confluentie na incubatie moet 70%-80% zijn. 3. Raman spectrale beeldvorming en spectrale verwerking Opmerking: Hoewel Raman-spectroscopie-systemen commercieel beschikbaar zijn, is het Raman-spectroscopie-systeem dat hier wordt gebruikt een zelf gebouwde lijn Scanning-confocale Microscoop die eerder werd beschreven7,8. Kort, dit systeem is uitgerust met een 532 nm diode gepompt Solid-State Laser. Het laserlicht wordt in een vlak gevormd met behulp van een cilindrische lens, waarmee de meting van 400 spectra in één blootstelling mogelijk is. Raman spectra werden opgenomen met behulp van een gekoelde CCD camera gemonteerd op een polychromator die gebruik maakt van een 1.200 groeven/mm roosters om de spectrale resolutie van de vingerafdruk regio te maximaliseren (van 500-1800 cm-1). Dit spectrale gebied bevat een hoge dichtheid van frequenties die specifiek zijn voor moleculen die Raman verstrooiing genereren. Een water-immersionobjective lens (NA = 0,95) wordt ook gebruikt. De ruimtelijke resolutie van dit systeem is ~ 300 nm en de spectrale resolutie is 1 cm-1. Om de overleving van de cel tijdens het experiment te garanderen, wordt een micro kamer gebruikt die is bevestigd op een gemotoriseerde Microscoop. Controleer vóór de spectrale metingen de uitlijning van de optiek. Een 50 μm pinhole kan worden gebruikt om te controleren of de pinhole en laser positie exact overeenkomen. Voer de spectrofotometer gleuf in wanneer u zoveel mogelijk vernauwde. Gebruik ethanol om de spectrofotometer te kalibreren vóór elk experiment. Om dit te doen, plaats EtOH in een schotel met glazen bodem, meet het spectrum op een gegeven laserintensiteit (gemeten bij monster) voor 1 s, en koppel de piek aan bekende golflengten7. Minimaliseer de laserintensiteit van het monster tot ~ 2,4 mW/μm2 , zodat cellen Laser blootstelling overleven. Stel de micro kamer in op 5% CO2 en 37 °c. Zodra het Microscoop-systeem gereed is, verwijdert u cellen uit de incubator en spoelt u de cellen onmiddellijk 2x met de buffer opgewarmd PBS (37 °c) en voegt u vervolgens 2 ml opgewarmde PBS (37 °c) of DMEM toe om de cellen te hervatten.OPMERKINGEN: zowel PBS als FluoroBrite-gebaseerde media zijn voldoende opties voor Raman-spectroscopie-metingen omdat ze een minimaal achtergrond signaal produceren. Voeg 10 μL water toe aan de objectief lens met water onderdompeling en plaats het glazen onderste celschaaltje voorzichtig op de Microscoop. Meet elke cel door de laser lijn te focussen. Een 15 s blootstellingstijd per cel volstaat hier om een dwarsdoorsnede van een cel te verkrijgen met een duidelijk Raman-signaal. Een Galvano mirror maakt het scannen van één cel of een groep cellen binnen enkele tientallen minuten mogelijk.OPMERKINGEN: een hogere resolutie van volledige spectrale beeldvorming van cellen vereist meer tijd en kan tot foto beschadiging leiden. Hier werden cellen gemeten met behulp van een enkele regel blootstelling om een dwarsdoorsnede van elke cel te verkrijgen. Deze aanpak is een goede ruil om de doorvoer te verhogen en voldoende informatie te verkrijgen om cellen te discrimineren, terwijl ook de levensvatbaarheid van de cel wordt gewaarborgd door foto schade te beperken. 4. voorbewerken van spectrale gegevens en multivariate analyses Opmerking: voor verwerking is een noodzakelijke stap voorafgaand aan aanvullende analyse om ongewenste technische variaties binnen de spectrale gegevens te verwijderen. Als gevolg van de diversiteit van de methoden en software, een uitputtende lijst kan niet worden verstrekt, en er zijn veel nuttige beoordelingen gevonden in de literatuur7,8. In deze sectie beschrijven we kort de benadering die wordt gebruikt voor het analyseren en interpreteren van spectrale Raman-gegevens die zijn verkregen uit levende enkelvoudige cellen. Pak Raman-afbeeldingen uit en voorverwerken om mogelijke kosmische straling te verwijderen.Opmerking: spectrale as van spectra verkregen tijdens verschillende dagen/weken/maanden kan enkele variaties als gevolg van kleine technische variaties tijdens de kalibratie met behulp van ethanol omvatten. Dit zal een sterk effect hebben op latere multivariate analyses en statistische vergelijkingen. In het geval dat experimenten worden uitgevoerd tijdens verschillende weken/maanden, worden kleine optische variaties verwacht. In dit geval moeten gegevens worden geïntermuleerd om te corrigeren voor eventuele spectrale verschuivingen van de gegevens in experimenten. Interpolatie met behulp van kubieke spline wordt hier gebruikt. Na deze stap moet alle Spectra Axis worden uitgelijnd. Voor de daaropvolgende analyse wordt een bereik van 500-1800 cm-1 overwogen. Extraheer spectrale gegevens van cellen en achtergrond (afwezigheid van cellen) van elke afbeelding met behulp van een zelf gemaakt algoritme. Trek het achtergrond signaal af van het signaal van de cel. Vervolgens, gemiddelde de spectra van de resterende pixels, die moet overeenkomen met een enkele cel. De volgende stappen worden uitgevoerd met behulp van de 2D-spectra van cellen. Uitvoeren van een basislijn correctie met behulp van de ModPoly9 of een ander algoritme dat naar schatting voldoende passen. Trim het spectrale bereik tot 600-1700 cm-1 om het vingerafdruk gebied te selecteren en zorg ervoor dat er geen ongewenste randeffecten zijn op de spectra als gevolg van een slechte polynoom fitting. Voer een normalisatie stap uit zoals vector normalisatie (intensiteit bij elk vibratie wordt gedeeld door de globale L2-norm of de maximale enkelvoud waarde van een spectrum) om de spectrale intensiteit10te normaliseren, hoewel andere normalisatie kan worden overwogen. Bereid een gegevensset met het juiste label voor elke klasse/voorwaarde.Opmerking: vergelijkende spectrale analyses kunnen worden geperforeerd om de aard van mogelijke verschillen tussen celklasse/condities te onderzoeken (bijvoorbeeld door het gemiddelde spectrum van de controlegroep af te trekken naar andere groepen om belangrijke regio’s te identificeren [zoals potentiële biomarkers]). Er kunnen ook ANOVA-en Fisher-scores berekeningen worden uitgevoerd10. Om behandelde en onbehandelde cellen te identificeren op basis van spectrale kenmerken, kunnen multivariate analyses worden toegepast. Een genormaliseerde spectrale gegevens moeten worden gebruikt als een gegevensset training en een onbekende gegevensset (zonder label) van een replicaatexperiment moet worden gebruikt als testgegevens, indien mogelijk.Opmerking: discriminant analyse uitgevoerd op een aantal vector van een hoofdcomponent analyse (PCA-DA10), projectie op latente scores gevolgd door discriminant analyse (pls-da), en ondersteuning vector machines (SVM)11 zijn modellen vaak gebruikt in het veld, en elk presenteert verschillende statistische overwegingen. Voor verwerking van gegevens moet bijgevolg worden uitgevoerd. Gebruik machine learning die past bij de experimentele doelstellingen. Hier wordt een projectie op latent structuur (PLS) model gebouwd met behulp van de spectrale vingerafdruk regio van Raman spectra (600-1710 cm-1)11,12. Mean-Center de gegevens indien nodig. Voor kruisvalidatie van het model kunnen verschillende technieken worden toegepast.Opmerking: hier wordt een Venetiaanse blinde kruisvalidatie met 10 Splits toegepast. De complexiteit van het model (aantal onderdelen of latente variabele) moet worden getest, zodat het beste model minimaliseert de waarde van de root mean Square error (RMSE). Er werd vastgesteld dat drie latente vectoren (Lv’s) de beste discriminatie met onze gegevensset verschafte. Bepaal welke Raman spectrale pieken bijdragen aan de discriminatie van de cellen (bijvoorbeeld door de Score van variabel belang in projectie [VIP] te plotten voor elke Raman-vibratie of de grootte van de regressie coëfficiënt).OPMERKINGEN: de VIP-Score van een variabele wordt berekend als een gewogen som van de gekwadrateerde correlaties tussen de PLS-DA-componenten en de oorspronkelijke variabele. Details over pls en VIP scores algoritme kan worden gevonden in de literatuur11,12. 5. opstelling en procedures voor het bemonsteren van één cel Bevestig het bemonsteringssysteem van de cel op de Raman-Microscoop zoals weergegeven in Figuur 1. Sluit de 3D-Micro manipulator aan op de glazen capillaire houder die is bevestigd aan een lege spuit voor monster zuigen door een negatieve druk toe te passen (Figuur 1). Stel de Microscoop in op een hoog vergrotings veld (40x) om de punt van de glazen capillaire te observeren en zorg ervoor dat deze niet gebroken is. Bedien de positie van het glas capillair met behulp van de micro manipulator (x-, y-, z-assen). Zorg ervoor dat de capillaire punt gecentreerd is in het gezichtsveld en verplaats vervolgens de capillaire omhoog op de z-as om de cultuur schotel later goed te laten zien.Opmerking: micro sampling van de cellen wordt uitgevoerd door het Glazen capillair voor cellen met diameters tussen 10-15 μm. Een capillair met een boring van ~ 5 μm wordt aanbevolen. Als de boring grootte te klein is, de capillaire tip zal worden aangesloten door de cel, en als het te groot is, de gevoeligheid van latere MS metingen kan worden aangetast. Plaats de monster plaat/schotel op het podium van de Microscoop, pas de vergroting en scherpstelling aan, selecteer de doelcel op de rooster schotel en verplaats deze naar het midden van de weergave. Verlaag vervolgens voorzichtig het Glazen capillair met behulp van de micromanipulator (z-as) tot de punt in de focus komt.Opmerking: Zorg ervoor dat u het capillair niet in de x-en y-as beweegt totdat het capillair scherp is. Raak onder microscopische observatie de doelcel aan met de capillaire Tip en begin met het toepassen van negatieve druk met behulp van de spuit om de cel in de capillaire tip te vangen. Neem deze procedure op door een foto of video te maken om de timing en de gezogen locatie van de cel nauwkeurig te controleren, indien nodig. Beweeg de capillaire omhoog op de z-as. Verwijder vervolgens het capillair van de capillaire houder met behulp van een tang ter voorbereiding op MS-analyse. 6. massaspectrometrie metingen Kalibreer de massa nauwkeurigheid van het MS-instrument volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Zorg er na kalibratie voor dat de massa fout niet groter is dan 3 ppm. Optimaliseer het MS-instrument met parameters die het meest geschikt zijn voor de analyt van belang.Opmerking: in het geval van Tamoxifen en 4-OHT-analyse worden de instrument parameters ingesteld op het volgende: inlaat capillaire temperatuur: 400 °C, sproei spanning: 1500 V, automatische versterkingsregeling (AGC): 5.00 E + 06, S-lens RF-niveau: 90%, SIM-bereik: 347-397 m/z, SIM maximale injectie tijd: 200 MS, SIM-resolutie: 140.000 FWHM, MS/MS-bereik: 50-400 m/z, MS/MS AGC target: 2.00 E + 05, MS/MS maximale injectie tijd: 100 MS, MS/MS resolutie: 17.500 FWHM, MS/MS isolatie venster: 1 m/z, MS/MS genormaliseerde botsingsenergie (NCE): 35 Stel een automatische verwervingsmethode in met een duur van 5 min voor de SIM-modus om relatieve kwantatie te bereiken, en een andere MS/MS-methode voor positieve identificatie van het medicijn en de metaboliet ervan. De parameters van de overnamemethode moeten worden ingesteld op de geoptimaliseerde waarden die worden vermeld in stap 6,2. Bereid het ionisatie-oplosmiddel onder een rook afzuigkap voor. De samenstelling van het oplosmiddel is afhankelijk van de analyt van belang. Hier, de gebruikte organische oplosmiddel bestaat uit 80% MeOH, 10% DMSO, en 0,1% mierenzuur. Meng vóór de metingen een geschikte interne standaard met het organische oplosmiddel. In dit experiment, 5,31 nM van D5-Tamoxifen wordt gebruikt als een interne standaard. Om valse positieven te voorkomen, aspireren de media rond de cellen behandeld met de drug met behulp van een 1 μm boring-grootte capillair met constante microscopische observatie om te voorkomen dat het bemonsteren van cellulaire delen. Voeg 2 μL van het ionisatie-oplosmiddel toe aan het brede uiteinde van het capillair dat de media bevat met behulp van een pipet dat is bevestigd aan tips voor de lader. Analyseer vervolgens de bemonsterde media door MS, Controleer op de aanwezigheid van de analyt van belang (normaalgesproken moet het niet detecteerbaar zijn). Voeg 2 μL het ionisatie-oplosmiddel toe aan het capillair dat de cel bevat, bevestig het capillair aan een nanoelectrospray-adapter (nano-ESI) die is aangesloten op een geschikte massaspectrometer en start de automatische verwervingsmethode. 7. massaspectrometrie gegevensverwerking en-analyse Opmerking: alle geschikte software kan worden gebruikt voor het uitvoeren van gegevensanalyse. Als onderzoekers echter gegevensanalyse willen uitvoeren met behulp van een software die niet wordt geleverd door de MS-leverancier, moeten de onbewerkte gegevens worden geconverteerd van de indeling van de propriëtaire leverancier naar een open indeling of als een tekstbestand eerst (wat hier is gedaan). Normaliseer de gegevens door het piek gebied van de analyt van interest (s) te delen door die van de interne standaard van dezelfde MS-scan. Vervolgens transformeert u de piek verhoudingen om scheet te verminderen. Plot de genormaliseerde intensiteit van het geneesmiddel of de metaboliet ervan als een Boxplot of dichtheids curve om de verdeling over afzonderlijke cellen te visualiseren. Hier wordt R statistische software gebruikt, samen met het ggplot2 pakket. Bereken de metaboliseerde drug naar unmetabolized drug ratio door het delen van de overvloed van de drug metaboliet door die van de niet-metaboliseerde bovenliggende molecuul in elke cel (dat wil zeggen, 4-OHT en tamoxifen, respectievelijk.Opmerking: de correlatie tussen variaties van specifieke Raman pieken van belang en de variaties in MS pieken van het geneesmiddel of de metabolieten ervan kunnen worden bestudeerd. Dit is een aanvulling op de mogelijke correlatie tussen de drug zelf en de metaboliet in enkele cellen. Dit kan worden gedaan door de correlatiecoëfficiënt van Pearson te berekenen met behulp van een tweezijdige test. Er moet ook rekening worden gehouden met geavanceerdere integratieve benaderingen.