一个集成拉曼光谱和质谱平台，用于研究单细胞药物接受、代谢和效果

1. 细胞培养 适当培养介质中感兴趣的培养单元。可添加青霉素-链霉素以避免污染。在HepG2细胞的情况下，培养细胞在培养基中含有Dulbeco的改性Eagle的培养基（DMEM），辅以10%的胎儿牛血清（FBS）和0.1%青霉素链霉素。为了便利拉曼光谱测量，可以在0.1%明胶涂层玻璃底盘或石英幻灯片上生长细胞。 在加湿培养箱中，在37°C和5%CO2下孵育细胞2天。 同步细胞培养达到70%的汇合。 亚培养细胞在35毫米玻璃底网格盘或石英幻灯片中使用同一介质，播种密度为0.7 x 106，然后在37°C孵育24小时。注：培养皿或幻灯片可以预涂有胶原蛋白或明胶涂层溶液，培养表面比为5微克/厘米2，以进行修复，确保其在测量过程中存活。 2. 药物治疗 从培养箱中取出细胞培养物，用预热的PBS缓冲液（37°C）洗涤2倍。注：在50%-60%的汇合下，最好去除用于药物治疗的细胞。 在35毫米培养皿中将细胞分成药物处理和未经治疗的子组。 将选择的药物与文化介质混合。例如，将他莫西芬溶解在二甲基亚硫酸盐（DMSO）中，并与培养基体混合，以获得2 mL的最终体积和10μM的他莫西芬浓度。这将是药物治疗组。 将相应的溶剂体积 （DMSO） 混合到介质中作为对照，以研究 DMSO 的影响。这将是控制组。 在步骤 2.3-2.4 中准备的 2 mL 中孵育两组，以 24 小时。孵育后的预期汇合率应为70%-80%。 3. 拉曼光谱成像和光谱处理 注：虽然拉曼光谱系统已上市，但此处使用的拉曼光谱系统是一种自制线扫描共聚焦显微镜，之前描述为 7、8。简而言之，该系统配备了532nm二极管泵送固态激光器。激光使用圆柱透镜形成平面，允许在一次曝光中测量 400 个光谱。拉曼光谱是使用安装在多色计的冷却CCD相机录制的，该摄像机使用1，200个凹槽/毫米光栅来最大化指纹区域的光谱分辨率（从500-1，800厘米-1）。该光谱区域包含特定于产生拉曼散射的分子的高密度频率。还使用浸入式镜片（NA = 0.95）。该系统的空间分辨率为+300nm，光谱分辨率为1cm-1。为了确保实验期间的细胞存活，使用固定在电动显微镜台上的微室。 在进行光谱测量之前，请验证光学器件的对准。50 μm 针孔可用于验证针孔和激光位置是否完全匹配。尽可能缩小时输入分光光度计狭缝。 在每次实验之前，使用乙醇校准分光光度计。为此，将 EtOH 放在玻璃底盘中，以给定的激光强度（在采样时测量）测量 1 s 的光谱，并将峰值与已知波长7相关联。 将样品上的激光强度最小化至±2.4 mW/μm2，使细胞在激光照射下存活下来。 将微室设置为 5% CO2和 37 °C。 一旦显微镜系统准备就绪，从培养箱中取出细胞，立即用加热的PBS（37°C）缓冲液冲洗细胞2x，然后加入2 mL的加热PBS（37°C）或DMEM，以重新悬浮细胞。注：PBS 和基于氟布里特 DMEM 的介质都是拉曼光谱测量的充分选择，因为它们产生的背景信号最小。 将 10 μL 的水添加到浸入式物镜中，并巧妙地将玻璃底细胞盘置于显微镜台上。 通过聚焦激光线测量每个电池。每个细胞15s的暴露时间足以获得具有清晰拉曼信号的细胞的横截面。galvano镜像允许在几十分钟内扫描一个细胞或一组细胞。注：细胞全光谱成像的更高分辨率需要更多的时间，并可能导致光损伤。在这里，使用单线暴露测量细胞，以获得每个细胞的横截面。这种方法是一个很好的权衡，以提高吞吐量和获得足够的信息，以区分细胞，同时通过限制光损伤确保细胞的生存能力。 4. 光谱数据的预处理和多变量分析 注： 预处理是附加分析之前的必要步骤，以便消除光谱数据中不需要的技术变化。由于方法和软件的多样性，无法提供详尽的列表，在文献7，8中发现许多有用的评论。在本节中，我们简要介绍了用于分析和解释从活的单细胞获得的光谱拉曼数据的方法。 提取并预处理拉曼图像，以消除可能的宇宙射线干扰。注： 不同天/周/月获得的光谱光谱轴可能包含一些变化，因为使用乙醇校准过程中技术变化很小。这将严重影响后续的多变量分析和统计比较。如果实验在不同周/月进行，则预期光学变化很小。在这种情况下，必须对数据进行插值，以纠正数据在实验中的最终光谱偏移。此处使用使用立方样条线的插值。此步骤后，所有光谱轴都应对齐。考虑在500-1，800厘米-1的范围内进行后续分析。 使用自制算法从每个图像中提取单元格和背景的光谱数据（缺少单元格）。从电池信号中减去背景信号。然后，对剩余像素的光谱进行平均，该光谱应对应于单个单元格。以下步骤使用细胞的 2D 光谱执行。 使用 ModPoly9或它估计足够拟合的任何其他算法执行基线校正。将光谱范围修剪为 600-1，700 cm-1，以选择指纹区域，并确保由于多项式拟合不良，对光谱没有不必要的边缘影响。 执行规范化步骤，如矢量规范化（每个波数的强度除以全局 l2 规范或光谱的最大奇异值），以规范化光谱强度10，尽管可以考虑其他规范化。 为每个类/条件准备具有相应标签的数据集。注：可以进行比较光谱分析，以探讨细胞类/条件之间可能存在的差异的性质（例如，通过将对照组的平均光谱减去其他组，以确定感兴趣的区域[如潜在的生物标志物]）。ANOVA和费舍尔分数计算也可以执行10。 为了根据光谱特征识别经过处理和未经处理的细胞，可以应用多变量分析。规范化的光谱数据应用作训练数据集，复制实验中的未知数据集（无标签）应用作测试数据（如果可能）。注：对主要分量分析（PCA-DA10）的某些向量执行的区分分析，对潜在分数进行投影，然后是鉴别性分析（PLS-DA），支持向量机（SVM）11是现场常用的模型，每种模型都有不同的统计考虑因素。因此，应对数据进行预处理。 使用适合实验目标的机器学习。在这里，利用拉曼光谱的光谱指纹区域（600-1，710厘米-1）11、12，构建潜质结构（PLS）模型。根据需要对数据进行均心中心。对于模型的交叉验证，可以应用不同的技术。注： 此处应用了具有 10 个拆分的威尼斯盲交叉验证。应测试模型复杂性（组件数或潜在变量数），以便最佳模型将根均方误差 （RMSE） 值降至最低。结果发现，三个潜在向量 （LV） 为我们的数据集提供了最佳区分。 确定哪些拉曼光谱峰有助于对细胞的区分（例如，通过绘制每个拉曼波数或回归系数的幅度在投影 [VIP] 中可变重要性的分数）。注：变量的 VIP 分数计算为 PLS-DA 组件和原始变量之间的平方相关性的加权总和。有关 PLS 和 VIP 分数算法的详细信息，请参阅文献11、12。 5. 单单元取样设置和程序 将细胞采样系统固定在拉曼显微镜上，如图1所示。通过施加负压将 3D 微操作器连接到连接到空注射器上的玻璃毛细管支架，以便吸吮样品（图1）。 将显微镜设置为高放大倍率场（40 倍），以观察玻璃毛细管的尖端并确保其未损坏。使用微操作器（x-、y-、z 轴）控制玻璃毛细管的位置。确保毛细管尖端位于视场中，然后在 z 轴上向上移动毛细管，以便稍后为培养皿提供间隙。注：细胞的微采样由玻璃毛细管对直径在10-15 μm之间的细胞进行。建议使用孔径为 ±5 μm 的毛细管。如果孔尺寸太小，则毛细管尖端将被电池插入，如果尺寸过大，则后期 MS 测量的灵敏度可能会受到影响。 将样品板/碟放在显微镜的舞台上，调整放大倍率和对焦，选择网格盘上的目标细胞，并将其移到视图中心。然后，使用微操作器（z 轴）小心地降低玻璃毛细管，直到尖端进入焦点。注：在毛细管聚焦之前，请确保不要移动 x 轴和 y 轴中的毛细管。 在微观观察下，用毛细管尖触摸目标单细胞，然后开始使用注射器施加负压，将细胞困在毛细管尖端内。如有必要，通过拍摄照片或视频来准确检查细胞的定时和吸合位置，从而记录此过程。 在 z 轴上向上移动毛细管。然后，使用钳子将毛细管从毛细管支架上分离，为 MS 分析做准备。 6. 质谱测量 根据制造商的建议校准 MS 仪器的质量精度。校准后，确保质量误差不超过 3 ppm。 优化 MS 仪器，以最适合感兴趣的检测仪的参数。注：在塔莫西芬和4-OHT分析的情况下，仪器参数设置为：入口毛细管温度：400°C，喷涂电压：1500 V，自动增益控制目标（AGC）：5.00E+06，S透镜射频电平：90%，SIM范围：347-397 m/z， SIM 最大注入时间：200 ms，SIM 分辨率：140，000 FWHM，MS/MS 范围：50-400 m/z，MS/MS AGC 目标：2.00E+05，MS/MS 最大注射时间：100 ms，MS/MS 分辨率：17，500 FWHM，MS/MS 隔离窗口：1 m/z，MS/MS 标准化碰撞能量（NCE）35。 设置一种持续时间为5分钟的自动采集方法，以实现相对定量，另一种MS/MS方法用于药物及其代谢物的阳性识别。采集方法的参数应设置为步骤 6.2 中提到的优化值。 在烟机罩下准备电离溶剂。溶剂成分取决于感兴趣的合成物。这里使用的有机溶剂包括80%MeOH、10%DMSO和0.1%的甲酸。 在测量之前，将适当的内部标准与有机溶剂混合。在本实验中，5.31 nM 的 d5-他莫西芬用作内部标准。 为避免误报，使用1μm孔状毛细管对药物治疗的细胞周围介质吸气，并持续进行微观观察，避免对任何细胞部件进行取样。 使用连接到装载机尖端的移液器，将 2 μL 电离溶剂添加到毛细管的宽端，其中包含介质。然后，通过 MS 分析采样介质，检查是否存在感兴趣的分析剂（通常，它不应被检测到）。 将电离溶剂加入2 μL，将电离溶剂添加到包含电池的毛细管中，将毛细管固定到连接到合适质谱仪的纳米电喷适配器（纳米-ESI）上，然后启动自动采集方法。 7. 质谱数据处理和分析 注：任何合适的软件都可用于执行数据分析。但是，如果研究人员希望使用 MS 供应商未提供的软件执行数据分析，则应首先将原始数据从专有供应商格式转换为打开格式或作为文本文件（在此处完成）。 通过将利益关系分子的峰值区域除以同一 MS 扫描中内部标准的峰值区域来标准化数据。然后，对数变换峰值比率以减少偏斜度。 将药物或其代谢物的归一化强度绘制为箱形图或密度曲线，以可视化单个细胞之间的分布。在这里，使用R统计软件，以及ggplot2软件包。 通过将药物代谢物的丰度除以每个细胞中未代谢的父分子（即4-OHT和他莫西芬）来计算代谢药物未代谢药物比率。注：可以研究特定拉曼兴趣峰的变化与药物或其代谢物MS峰的变化之间的相关性。这是药物本身与单细胞中代谢物之间可能相关性的补充。这可以通过使用双尾测试计算 Pearson 相关系数来实现。还应考虑更先进的综合方法。