低温圈中的碳通量尚待评估,但对气候变化至关重要。在这里,我们展示了一种新型原型设备,它基于激光诱导荧光发射(L.I.F.E.)技术,在超高空环境中捕获光动电位,在原位条件下提供高光谱和空间分辨率数据。
全球变暖影响各种生态系统中的微生物群落,特别是低温层生境。然而,在极端环境中,对微生物介导的碳通量知之甚少。因此,在很少的研究中描述的样品采集方法意味着两个主要问题:A) 高分辨率数据需要大量的样本,这在偏远地区很难获得;b) 高分辨率数据需要大量的样本。(b) 高分辨率数据需要大量的样本,这在偏远地区是很难获得的;B) 不可避免的样品操作,如切割、锯切和冰芯熔化,导致对原地条件的误解。在这项研究中,提出了一种既不需要样品制备,也不需要样品销毁的原型装置。该装置可用于地面和冰生态系统中具有高光谱和空间分辨率的原位测量,并基于Laser-I-F-F.E.技术。 光自营养化前体群落可以通过检测光色素中的L.I.F.E.特征来识别。演示了用于叶绿素衍生素a (chla) (405 nm 激光激发) 和 B-phycorrin (B-PE) (532 nm 激光激发) 的 L.I.F.E. 仪器校准。为了验证这种方法,L.I.F.E. 数据通过涉及颜料提取和随后的吸收光谱的定量的常规方法获得批准。原型在野外的适用性在极端极地环境中得到了验证。在摩洛哥甜点和奥地利岩石冰川的火星模拟模拟期间,对陆地生境进行了进一步测试。L.I.F.E. 仪器支持对具有可接受操作物流的大片区域进行高分辨率扫描,并有助于更好地了解全球变化背景下的上冰川社区的生态潜力。
冰层蕴藏着海冰、冰川、高山湖泊、雪区、湖冰、融水流和永久冻土。这些区域覆盖了地球大约11%的陆地1,2,被大气层作为公认的低温层环境所覆盖。最近的研究表明,巨大的低温圈正在迅速退缩3,4。南极5、6、阿尔卑斯山7、北极8、其他地区出现负冰质量平衡。冰盖和冰川的退缩导致我们地球上最大的淡水水库枯竭。在一些地区,冰川退缩势不可挡。
长期以来,冰生态系统被认为是无菌环境。然而,尽管条件恶劣,地球低温圈中活跃生命的存在是显而易见的9,10,11,12,13,14,15.由于冰的融化导致冰层大量流失,冰层正在经历生物活动的变化,影响到邻近的生境。为了理解这些部分不可逆转的变化,我们需要方法,以高空间和时间分辨率在原位条件下研究冰中的生物活动。
在上冰川环境中,可以在低温石洞、雪盖、融化的水、溪流和裸露的冰面中找到生命。然而,最明显的上冰川栖息地是低温石洞。它们出现在全球的冰川环境中,最初由瑞典探险家阿道夫·埃里克·诺登斯克约尔德在1870年16、17年对格陵兰岛的探险中描述。这个名字源自希腊语单词”kryos”(冷)和”科尼亚”(灰尘)。Aeolian衍生的深色有机和无机碎屑附着在冰面上,并局部减少反光。太阳辐射促进碎片融化成更深的冰层,在9号底部形成圆柱形盆地,形成沉积物(低温石)。冷冻层孔覆盖0.1-10%的冰川消融区11。
冷冻生物群落由病毒、真菌、细菌、蓝藻、微藻和原生动物组成。根据地区的不同,还可以发现元类生物,如轮虫、线虫、食虫、龙舌兰和昆虫幼虫。爱德华兹等人18人将低温洞描述为”冰冷的热点”。他们还追踪了低温光酸孔中负责N、Fe、S和P循环的功能基因。迷你湖生态系统以温暖和营养丰富的栖息地11的速度呼吸和光合。这些发现强调了微生物固存在上拉环境中的重要作用。除了低温洞中的生活社区外,裸露的冰面上还栖息着冰藻。他们的生理学研究得很好,但他们的空间分布还没有被评估20。它们在上拉环境中的存在减少了反时率,从而促进融化,导致营养物质的外露和营养输入到下游生境9。温度升高,因此液态水供应增加,影响了这些冰冻生态系统的净生态系统生产力。
在上拉冰川环境中,光合活性生物将无机碳和氮转化为有机的微生物食物网21、22的可用来源。到目前为止,很少有研究可以估计上拉的碳通量11,20,23。拟议碳通量率的差异源于较低的空间和时间数据分辨率。此外,在低温石洞外,对上拉面社区的空间分布几乎没有评估。库克等人20日在他们的模型中预测,由于表面覆盖面积大,高升藻群落的碳含量比当代低温石洞多11倍。由于缺少现场检测和定量工具,确保样品完整性的上藻群落的检测仍然受到阻碍。
为了应对后勤方面的困难,对冰生态系统的研究频率低于温带地区的生境。数据分辨率取决于评估的样本数量,并取决于研究地点的可访问性。标准取样方法,如锯、腐蚀和随后熔化,涉及微生物群落的操纵。例如,在无实质性干扰的情况下,使用标准方法,在固体冰样品中进行叶绿素a(chl a)评估是不可能的。因此,被调查的微生物群落内因熔融引起的温度变化是不可避免的。针对22号中光系统II和其他细胞结构的热度,实验室对融化的冰样品的分析总是会导致原位条件的伪造。
无损原位测量是获得可靠数据的唯一合理方法。这一目标可以通过基于荧光的方法来实现。由于其光收集功能,chla和B-b-b-PE存在于生物体中,这些生物体在超冰川环境中促进碳循环,阿内西奥等人已经证明了这一点。因此,这些荧光分子是冰生态系统中微生物介导碳通量定量的合适生物标志物。
在这项研究中,我们介绍了一种新型非侵入性工具在陆地和冰生态系统中就地定量chla和B-PE分子的开发、校准和应用。原型装置基于激光诱导的荧光发射,也称为L.I.F.E。光学仪器 (图 1) 捕获激光诱导荧光激发后的荧光生物标志物特征.该过程是非破坏性的,可以在研究现场或实验室进行。
图1:L.I.F.E.原型。左图:没有保护盖的仪器照片。右图:仪器的示意图。总质量 = 5.4 千克(激光和光学设备 = 4.025 千克,笔记本电脑 = 1.37 千克)。铝制框架 = 32.5 厘米 x 20.3 厘米 x 6.5 厘米光学管:18.4 厘米 x 4 厘米(直径)。CCD:蓝狐mv220g传感器;F:伺服式长通滤波器(450 nm 和 550 nm);L:光学透镜;M1:镜子;M2:二色镜;MC:微控制器;P:棱镜;PBS:偏振光束分割器;S: 由可调节剃须刀刀片制成的狭缝孔径。比例尺 = 70 毫米。请点击此处查看此图的较大版本。
便携式双波长套件重 4.5 千克,与外部计算机结合使用三脚架。现场设置快速简便。仪器连接到三脚架,镜头管与 USB 电缆和相机电缆一起连接到设备。外部计算机使用 USB 电缆连接到仪器。三脚架腿的调整方式使透镜管朝向并覆盖试样。然后,5 mW 绿色激光在通过偏振波束分离器后击中样品,该分离器将偏振光重定向到光谱仪的光轴。标本显示荧光灯,如图1所示为红色。一半的准直光通过偏振光束分割器,并通过伺服式长通滤波器聚焦,从而去除激光信号。接下来,信号击中由两个可调节剃须刀刀片组成的孔径狭缝。在传感器捕获信号之前,棱镜光谱将正交的光线与狭缝孔径分离。使用蓝色激光重复该过程。原始数据会自动传输到也用于软件操作的便携式计算机。
该仪器由外部计算机使用 LabVIEW 环境进行控制,该环境可与 CCD 摄像机同步拍照、打开/关闭激光器以及旋转长通滤光轮。图形用户界面 (GUI) 分为三个主要部分。曝光调整是手动完成的。尽管暴露时间和信号强度之间的校正是线性的(图2B),但最大暴露时间被限制在10s,因为较长的积分时间会导致信噪比的显著降低。注释字段用于示例描述 (图 2A)。在右侧部分,测量完成后,就会显示原始图像。此功能对于现场的即时数据评估至关重要(图 2C+E)。红色区域表示过度曝光的像素,可以通过减少曝光时间来避免。
后续的原始数据缩减过程与图像采集过程分离,可在图像采集后随时完成。
图2:用于数据采集和原始数据评估的L.I.F.E.图形用户界面。(A) 该软件支持手动输入示例说明的文本。(B) 在测量前可以调整曝光时间。(C+E)原始图像显示在界面的右侧。(E) 红色表示传感器饱和。(F)激活”运行测量”按钮会触发数据采集过程。在数组 (G) 中,将显示数据采集期间自动执行的所有命令。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:原始图像的示例。左图:丙酮溶液中标准chl的原始数据,用L.I.F.E仪器记录。由于器件的光学特性,信号显示为扭曲线。右图:每像素 (px) 的原始图像的解释。光谱轴(5 nm/px 分辨率)根据空间轴(30 μm/px 分辨率)绘制。请点击此处查看此图的较大版本。
12 位灰度原始图像显示了由于一维孔径狭缝引起的空间分量,以及由于 CCD 前面的棱镜而导致的光谱分量(图 3)。响应光学约束,原始图像被扭曲。因此,需要通过应用识别失真程度的代码来裁剪和扭曲它们。这是用软件向导完成的 (图 4)。接下来,使用 532 nm 激光完成波长校准。1,064 nm 红外激光器的频率翻倍,产生绿光。CCD 可以检测到这两种波长,因此,每个像素的光谱位置可以自动在变形图像中计算(图 4)。
然后,将图片裁剪到给定的波长范围(绿色激光测量为 550–1,000 nm,蓝色激光测量为 400–1,000)。对选定像素行中每个像素的灰色值进行计数和汇总。灰色值的范围为 0~255。之后,每个像素行都占一个数字。此外,屏幕软件指令还会导致生成一个绘图,显示根据空间坐标绘制的每个像素线的灰色值计数。这允许在样本中同时对 chla和 B-PE 进行定量空间区分。此外,可以从选定的像素线自动绘制样本的光谱属性。
图 4:去扭曲原始图像。左图:使用绿色激光捕获的原始图像。未使用筛选器。信号以 532 nm 和 1,064 nm 显示。曝光时间 = 0.015 s.中心:裁剪的 532 nm 信号用作用于变形一组图像的参考线。右图:从原始图像源中变形的图像。请点击此处查看此图的较大版本。
校准
将光子计数归化为1s的暴露时间后,颜料浓度和荧光强度之间存在线性相关性。 低柱高和低颜料浓度的样品导致对目标颜料的高估,与具有相同颜料浓度的柱高相比。此外,弱荧光信号需要长时间的曝光时间,才能在传感器上计算足够的光子。然而,长时间的集成时间也增加了传感器上的杂散光量,导致信噪比降低。在当前版本中,软件无法在数据缩减过程中区分噪声和信号。因此,低荧光强度测量导致颜料高估,因为噪声被计为来自目标颜料的信号。此外,较浓缩的颜料溶液的荧光强度比低浓度溶液具有更大的变异性。这种效应可以通过用于校准曲线的颜料溶液中的吸收过程来解释。
叶绿素定量的数据验证
过滤冰雪样品后,三维样品几乎作为二维样本出现在过滤器上。这证明L.I.F.E(面积密度)和分光光度数据(体积测量)之间的直接比较是合理的。
数据集(图8)表明,高颜料浓度导致低估,而低颜料浓度导致高估实际价值。这种效果可以通过滤饼的厚度以及样品的体积特性来解释。激光穿透深度取决于试样的光密度和厚度。由于激光不能在更深的层中诱导颜料荧光,因此低估了高颜料含量。然而,在薄滤饼中,由于颜料的面积密度低,低荧光信号被捕获。显然,滤波器本身在通过450nm长通滤波器后显示激光感应信号(图12)。该信号被误导性地计为从 chla派生的荧光信号。因此,薄和太厚的滤饼很难用L.I.F.E.仪器测量。
图12:来自GF/F滤波器上的厚(A)和薄(B)滤波器蛋糕的荧光信号。(A) 自着色可防止激光引起的较深层荧光,导致实际颜料浓度低估。(B) 滤饼的荧光发射,通过滤光反射覆盖。(C) 原始数据显示滤波器反射(灰色)。实验室衍生的荧光模式的光谱特性以红色表示。比例尺 = 45 mm。请点击此处查看此图的较大版本。
L.I.F.E. 原型的局限性
在数据缩减期间,MATLAB 编码软件通过对给定波长范围内的像素线进行求和来解释原始图像。该软件的当前版本没有区分有机信号和无机源信号。存在多个信号可能会导致对实际颜料含量的高估。低荧光强度导致长时间暴露,导致信噪比降低,促进上述效果(见图8和图12)。
图 13所示的大地岩石在以绿色和蓝光照射时呈现红色荧光灯。目前,目前尚不清楚荧光是矿物还是基于紫金素的分子。因此,生物和非生物信号的叠加可能会限制这种方法的应用,需要建立专门为L.I.F.E.原型制作的荧光数据库。
图13:在Ny-@lesund发现的地陆岩矿物荧光。岩石被532nm 50 mW激光(A) 和 405 nm 50 mW 激光 (B) 激发。两张照片都用偏振滤镜在镜头上拍摄,导致实际荧光颜色的伪造。(C) 真彩色图像,在白天条件下不使用偏振滤镜。比例尺 = 40 毫米。请点击此处查看此图的较大版本。
Beutler等人29日得出结论,海洋生态系统中蓝藻的特性发射光谱取决于环境条件。此外,代谢状态对光营养生物的荧光特性有影响30。L.I.F.E 仪器可以使用包含与环境条件相关的样本光谱信息的生物指纹库来区分藻类和蓝藻荧光模式。
在暗适应的chl分子中,所有反应中心都完全氧化,可用于光化学,没有荧光产量被淬火31。使用 L.I.F.E. 程序,标本首先由 532 nm 激光(绿色)激发,然后使用 405 nm 激光(蓝色)激发。在蓝色激光的第二次激发过程中,chla可能由于绿色激光先前激发而显示荧光响应降低。Chla吸收532nm波长的能量,尽管它与吸收最大波长32的距离。在 405 nm 处进行实际chl测量之前,绿色激光可能会导致光化学反应,激活目标颜料中的淬火机制。此外,海洋光营养生物的预照明没有导致450nm-600nm之间的光谱规范曲线发生变化,而荧光强度的标准偏差增加了25%29。根据不同的物种,荧光强度甚至随着先前激发而增加。本主题需要进一步调查。
适用性
我们在各种栖息地测试了L.I.F.E.仪器,重点是低温孔。由于测量过程中没有环境光,激光成功地应用于土壤和生物膜栖息地。当沉积物层阻挡孔底光时,可以测量低温颗粒(图14A,C)。薄沉积物低温岩孔可渗透从下方的杂散光(图14B)。杂散光干扰测量。因此,光秃秃的冰面中的颜料浓度在白天条件下还无法测量。信号处理工作目前正在进行中,以便在高环境光条件下运行系统。
图14:顶部有液态水的低温孔。(A) 冰川上的低温光酸与L.I.F.E.透镜管有关.刻度条 = 70 mm . (B) 沉积物层(红色)非常薄.杂光通过低温光层出血。(C) 沉积物层足够厚,足以阻挡下面的杂散光.这种类型的低温孔是可测量的L.I.F.E.仪器。请点击此处查看此图的较大版本。
最后,我们的L.I.F.E.仪器在陆地生境(如土壤、细菌垫、生物膜和冰川表面的低温石孔)中检测到光自营养生物。目标分子为chla和B-PE。空间分辨率为30μm/px。chla的检测限值为 250 pg/mL,B-PE 的检测限值为 2 纳克/mL。经过实验室校准,我们能够量化在北极研究地点采集的样本中的颜料含量。我们应用了自编程软件进行自动数据缩减过程。矿物的存在和测量过程中光线条件的变化的影响需要进一步调查。
随着气候变暖,温度升高导致液态水的可得性增加,从而在自营养化和异养性性质的冰面上增加生物活性。应积极努力就地检测异养生物,以全面了解低温圈中的活跃生命。这可以用其他目标颜料和适当的激光激发波长进行测试。因此,L.I.F.E. 提供了一个合适的监测系统,为全球变化和可能的天体生物学应用背景下的上天条件提供高时空分辨率。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢上校(IL)J.N.普里茨克,塔瓦尼基金会,美国,奥地利联邦科学,研究和经济部(闪闪发光的科学SPA04_149和SPA05_201),阿尔卑斯福森斯特尔奥贝格尔(AFO),奥地利空间论坛()[WF),罗曼·埃勒来自亨特图尔·艾斯·帕拉斯特,奥地利联邦林业和基地经理尼克·考克斯来自尼阿莱松德(斯瓦尔巴德)北极站。我们也感谢萨布丽娜·奥布韦格瑟、卡琳娜·罗夫纳和法比安·德鲁斯在拍摄过程中的帮助。最后,我们要感谢詹姆斯布拉德利给声音的伴随视频。
aceton | Merck | 67-64-1 | |
B-Phycoerythrin | Invirtrogen | P6305 | |
Chlorophyll a standard | Sigma-Aldrich | C6144-1MG | |
formaline | Merck | HT501128 | 36% |
GF/C filters | Whatman | WHA1822025 | 25mm diameter |
HCl | Merck | H1758 | 36,5-38% |
L.I.F.E. Prototype | University of Innsbruck | built on demand | |
LabView | National Instruments | Software, Laboratory Virtual Instrumentation Engineering Workbench | |
Leucine, L-[4,5-3H], 1 mCi | Perkin Elmer | NET1166001MC | radioactive |
Liquid scintillation cocktail Beckman Ready Use | Beckman | not more available, can be compensated by Ultra Gold, Packard | |
liquid scintillation counter | Beckman | out of stock | LSC 6000 IC |
NaH14CO3 (4 µCi/ml) | DHI Denmark | 4 μCi/ml, 1 ml | radioactive |
Osmonics polycarbonate filters | DHI Denmark | PCTE | 25mm diameter, 0,2µm pore size |
Polyscintillation vials | Perkin Elmer | WHA1825047 | 20ml |
sample tubes | Sigma Aldrich | T2318-500EA | Greiner centrifuge tubes, 50ml |
Spectrophotometer | Hitachi | NA | Model U2001, any photometer for absorption spectroscopy measuring at 664nm and 750nm would be appropriate |
trichloric acetic acid (TCA) | Merck | T6399 | 100% |
ultrasonic probe | nano lab | QS1T-2 |