核/細胞質タンパク質の密売を監視する原発性慢性リンパ球性白血病細胞の細胞分画

ここに記載されているCLL患者からの一次サンプルの使用は、スコットランド研究倫理サービス、NHSグレーターグラスゴーとクライド(英国)の西部によって承認されており、すべての作業は承認されたガイドラインに従って行われました。 1. 患者の血液サンプルからのCLL細胞の単離 以前に同意されたCLL患者からの末梢血サンプルは、白血球数(WCC)を伴うEDTA採血管の診療所から受け取られます。WCCに従って末梢血CLLサンプルを浄化する。WCC < 40 x 106セル/mL の場合は、ステップ 1.1.1 に進みます。WCC ≥ 40 x 106セル/mL の場合は、ステップ 1.1.2 に進みます。 すべてのEDTA血液管の内容物を50 mLの円錐遠心分離管に注ぎ、血液1mL当たり50μLのヒトB細胞濃縮カクテルを加えます。室温(RT)で20分間インキュベートし、ステップ1.1.2に進みます。 RT CLL洗浄バッファー(リン酸緩衝サリン(PBS)、0.5%胎児ウシ血清(FBS)および2 mM EDTA)で1:1の割合でサンプルを希釈します。 Aliquot RT密度勾配媒体をサンプル用の適切なサイズの円錐遠心管に(サンプルの30 mLまたはサンプルの15 mL用の15 mLチューブに4mLの50 mLチューブに10 mL)。 サンプルを密度勾配媒体の上に慎重に重ね、遠心分離機をRTで30分間400 x gにします。注:温度の変化が単核細胞の濃縮不良をもたらすので、サンプルが遠心分離機に置かれる前に遠心分離機がRTであることを確認し、突然のブレーキが液体界面を乱す可能性があるので、遠心分離機のブレーキをオフにします。 密度勾配媒体とCLL洗浄バッファーの界面で収集する単核細胞の白層を、プラスチックパスツールピペットを使用して新鮮な50 mL円錐遠心管に穏やかに収穫します。 単離された単層に40 mLのCLL洗浄バッファーを加え、細胞と遠心分離機をRTで10分間300xgで洗浄します。 上清を廃棄し、チューブの底部をフリックしてペレットを再懸濁し、ステップ1.5に記載の洗浄工程を繰り返す。 上清を廃棄し、ステップ1.6に記載の通りペレットを再懸濁し、次いでCLL洗浄バッファーのセットボリュームでペレットを再懸濁する(セルペレットのサイズに応じて最大40mL)。 トリパンブルーと血球計を使用して細胞を数えます。次に、CLL細胞の純度を確認するために細胞メトリーを流す。注:この段階では、CLL細胞を実験に使用する培地中の10 x 106細胞/mLの濃度で培養することができ、および/または10%ジメチルスルホキシド(DMSO)/FBSで凍結保存し、最大100 x 106細胞/バイアルの濃度で将来の作業を行うことができます。 2. CLL細胞のフローサイトメトリー 表 1 に記載されているように、12 mm x 75 mm 丸い底付きポリスチレンチューブにラベルを付けます。 チューブ2-5で、補償ビーズを1滴入れ、氷の上に保存します。適切な抗体の1 μL(表1に示すように、抗CD5、CD19、CD23またはCD45)をチューブ2~5に加え、氷上で20分間インキュベートし、氷のバケツの上に錫箔を置いて光から保護する。注:これらのチューブは、フローサイトメトリーテンプレートを設定するための補正コントロールとして機能します。 チューブ1、6、7に最大1 x 106 CLL細胞を入れ、各チューブに2 mLのFACSバッファー(PBS + 2S)を加え、RTで5分間300xgの遠心分離機を加えて細胞を洗浄する。 上清を捨て、細胞ペレットを含むチューブを氷の上に保管します。 細胞ペレットを再定積し、表1に示すようにチューブ7内の細胞に抗体の適切な組み合わせを追加し、FACSバッファーを用いて100μLの最終容積にする。抗体は、製造元のガイドラインに従って適切な濃度で使用されます。 FACSバッファーの100 μLでチューブ2および6の細胞ペレットを再ステーペンドします。 氷の上の細胞をインキュベートし、チューブ2~5の染色ビーズと一緒に、20分間光から保護します。 インキュベーションの後、すべてのチューブと遠心分離機に2 mLのFACSバッファーをRTで5分間加え、細胞を洗浄します。上清を捨て、チューブをそっとフリックしてビーズ/セルペレットを再懸濁します。 FACSバッファーの100 μLでチューブ1~5を再サスペンドし、フローサイトメーターで分析する準備ができるまで氷の上に置きます。 DAPI 溶液を使用直前に FACS バッファーで 0.05~0.2 μg/mL に希釈します。最適な濃度は変化する場合があり、滴定をお勧めします。 希釈DAPI溶液の100 μLでチューブ6と7を再中断し、細胞が汚れるように、氷の上にチューブを少なくとも5分間インキュベートします。注:死んだ細胞が標識されたままになるには、DAPIがバッファー内に存在する必要があるため、それ以上の洗浄は必要ありません。DAPIが追加されたら、4時間以内にフローサイトメーターで細胞を分析する必要があります。 フローサイトメーターを使用して細胞を分析します。 3. CLL細胞からの細胞内画分の調製 注:実験セットアップを計画する際には、細胞抽出物全体を生成できる未刺激/未処理細胞のウェルを含む。 10 – 20 x 106細胞/条件を使用してMEC1 CLL細胞株または単離された一次CLL細胞の所望の刺激および/または薬物治療を行う。細胞は、細胞下分画(ステップ3.4&3.5)または細胞全体抽出物を生成するために使用されます(ステップ3.6)。 ソリューション/チューブの準備:細胞が収穫される前に、分画の日に新鮮にすべての溶液/バッファーを準備します。溶液を必要な量まで氷の上に保管し、準備の4時間以内に使用してください。 PBS/ホスファターゼ阻害剤溶液:ホスファターゼ阻害剤1:20を1x PBSで希釈することによりPBS中のホスファターゼ阻害剤を調作する(すなわち、1x PBSの9.5mLにおけるホスファターゼ阻害剤の0.5mL)。注:ホスファターゼ阻害剤が沈殿していないことを確認します。沈殿物が存在する場合は、10分間50°Cに熱する。 低トニックバッファー:蒸留水中で1:10の低トニックバッファーの1:10希釈を行うことによって1x低トニックバッファーを調製します(すなわち、10倍の低トニックバッファーの50 μLをdH2Oの450 μ Lに)。 10 mMジチオスレイトール(DTT):蒸留水で1M DTTの1:100希釈を行って10mM DTTを調製する(すなわち、dH2Oの990 μLで1M DTTの10 μL)。注:DTTは非常に不整性なので、毎回これを新鮮に準備してください。繰り返し凍結/解凍サイクルを避けてください。 完全なリシス バッファー: 各実験に必要なバッファーの量を決定します。各サンプルには50 μLの完全なリシスバッファーが必要なため、10 mM DTTの5 μL(ステップ3.2.3)を44.5 μLのリシスバッファーに加え、プロテアーゼ阻害剤カクテルの0.5 μLを追加します。この量は、実験中のサンプル数に応じてスケールアップできます。 新たに刺激された細胞の刺激および/または薬物治療ごとに1.5mLのマイクロフュージチューブの4セット(ステップ3.3)、新たに生成された細胞質画分(ステップ3.4.3)、新たに生成された核画分(ステップ3.5.3)、および細胞全体にラベルを付けます。(ステップ3.6.3)。必要になるまで氷の上でこれらのマイクロフュージチューブを事前に冷やします。 4°Cで5分間200 x gで遠心分離することにより、個別に標識された1.5 mLマイクロフュージチューブとペレットに細胞を移します。上清を取り出し、氷冷PBS/ホスファターゼ阻害剤の1 mLで細胞を再中断します(ステップ3.2.1)。4°Cで5分間200xgで遠心分離によって細胞をペレットする。上清を取り除き、細胞ペレットを氷の上に保ちます。 細胞質画分の調製:1x低トニックバッファーの50 μLの細胞分画に使用する細胞ペレットを穏やかに再中断します(ステップ3.2.2)。細胞が膨れ上がるように15分間氷の上の細胞をインキュベートします。注:使用される低調球バッファーの体積は、細胞数に応じて経験的に増加させることができる。 各サンプルに洗剤0.8~2.5μL(1:20~1:60)を加え、10sの最高値で渦を加えます。 核分画と細胞質画分を分離するために特定の細胞タイプに使用する洗剤の最適な濃度を決定するには、最初に洗剤の勾配を実行します。1:20 ~1:60 の範囲(つまり、2.5 μL ~ 0.8 μL の洗剤を 50 μL の低トニック バッファーに含む)で十分である必要があります。注:ステップ3.4の低調圧バッファーの体積を調整する場合は、適切な洗剤比率が維持されていることを確認してください。 洗剤添加前後の位相コントラスト顕微鏡を用いて細胞を観察して細胞のリシスを確認します。細胞全体が、濃い暗黒の核を持つ大きく見えます。細胞質は、核の周りに明るいハローとして表示されます。注:適切な分解は、洗剤の勾配から生成された分解分画内の特定のタンパク質を分析するためにウェスタンブロッティングを使用することによってさらに確認される。 一旦lyslysを行い、4°Cで30sの14,000 x gでサンプルを遠心分離します。 上清をあらかじめ冷やされたラベルの付いたマイクロフュージチューブに慎重に移します。この細胞質画分は、さらなる分析のために必要になるまで-80°Cで保存することができる。残りのペレットには核分数が含まれています(ステップ3.5)。注:サンプルの繰り返し凍結/解凍サイクルを避けてください。 核分画の準備:各核ペレットを上下にピペッティングして、完全な分解バッファー(ステップ3.2.4)の50 μLで再中断します。注:完全なリシスバッファーの体積は、開始セル番号に従って経験的に調整することができる。 2.5 μLの洗剤を加えて、核膜に関連するタンパク質を10s.10s.氷上で30分間インキュベートします。 30sの最も高い設定の渦は、4 °Cで20分のために14,000 x gでサンプルを遠心分離する。 上清を、あらかじめ冷やされたラベルの付いたマイクロフュージチューブに移します。この核画分は、さらなる分析のために必要になるまで-80°Cで保存することができます。注:サンプルの繰り返し凍結/解凍サイクルを避けてください。 CLL細胞からの全細胞リサテス(WCL)の調製注:全細胞抽出物の調製は、核画分の調製と同時に行うことができる(ステップ3.5)。 完全な分解バッファーの100 μL(ステップ3.2.4で調製)で全細胞抽出ペレットを上下にピペッティングし、5μLの洗剤を加えて完全な細胞分解を確保します。氷の上でサンプルを30分間インキュベートします。 30sの最も高い設定の渦は、4 °Cで20分のために14,000 x gでサンプルを遠心分離する。 上清を冷やしたマイクロフュージチューブに移します。この全細胞リサートは、さらなる分析のために必要になるまで-80°Cで保存することができる。注:サンプルの繰り返し凍結/解凍サイクルを避けてください。 4. 細胞下画分の下流分析 注:このプロトコルでは、生成された細胞画分の分析は、標準プロトコルを用いてウェスタンブロッティングによって行われ、核および細胞質画分分に対して同じ細胞数/レーン(タンパク質の約10μgに相当)をロードした。 核分画と細胞質画分の間のタンパク質間取引の定量:信号強度の定量化、または自由に利用可能なウェスタンブロット解析ソフトウェアを使用した密度測定を通じて定量的ウェスタンブロット解析を実行します。 画像の読み込み:異なる開発機器から生成された西洋のブロット画像は、JPG、PNGまたはTIFFファイルとしてインポートする必要があります。16 ビットの深さの RAW ファイルをお勧めします。画像を読み込むには、ソフトウェア アイコンをクリックし、[インポート] にカーソルを合わせる。次に、[サードパーティの画像] をクリックします。イメージ ファイルを選択し、[開く]をクリックします。 画像の表示:イメージ リボンで、[表示]グループの[選択]ボタンをクリックします。[表示の調整]ダイアログが開き、必要に応じてさらに調整が可能になります。[イメージ LUT]タブの調整可能なスライダを使用して、明るさやコントラストなどの追加機能を実装します。 データ分析(チャネル選択解除):解析リボンをクリックします。1 つのチャネルのみを分析するには、解析対象のチャネルの選択を解除します。イメージ LUT でチャンネルの [チャンネルを表示しない] サムネイルをクリックすると、目的のチャンネルのみが表示されます。JPG、PNG、または TIFF ファイルとしてインポートされた画像は、複数の不要な RGB チャンネルの選択を解除する必要があります。 図形の追加:信号強度を定量化するには、[長方形を追加]をクリックして、画像に四角形を追加します。フィーチャーの中心(タンパク質バンドなど)をクリックして、その中心に長方形を配置します。または、図形を手動で描画するには、[四角形を描画]を選択します。目的の図形をすべて追加したら、[選択]をクリックして、選択ツールにカーソルを戻します。注:データは順番に生成される ID 番号で並べ替えられ、論理的な順序で複数の図形を追加します。 背景減算:バックグラウンドノイズを減らすには、[バックグラウンド]グループの最初のボタンをクリックし、ドロップダウンメニューから中央値を選択します。[バックグラウンド]ダイアログで境界線の幅を 3 に設定し、背景計算に使用するセグメントを選択します。使用するセグメントを選択するときは、イメージの背景を最もよく表すセグメントを選択します。注:バックグラウンドノイズは信号定量に影響を与える可能性があるため、対象の形状からの信号を正確に計算するには減算する必要があります。 トリム信号とトリム背景 – オプション:JPG、PNG、または TIFF 形式でインポートされたファイルは、タンパク質バンド内でピクセル彩度(強調表示/明るい領域)を示す場合があります。トリム信号とトリムの背景(Bkgnd)は、解析から飽和ピクセルを削除します。これらの値を表示するには、テーブル ビューの右側にある[列]ボタンをクリックして、トリム信号とトリム Bkgndをテーブルに追加します。注:ピクセルの飽和は、信頼性の低い定量化につながる可能性があります。飽和ピクセルは、図形内のピクセルの 5% 未満が飽和している場合にのみ削除できます。 データのエクスポート:テーブルの上にある [図形]タブをクリックします。密度メトリーでは、[シグナル]列の値が必要です。シグナルは、Bkgnd とエリアの積を差し引いたシェイプのピクセル強度値(合計)の合計です。[レポート] ボタンをクリックします。[名前を付けて保存]または[スプレッドシートを起動]をクリックします。信号 = 合計 – (Bkgnd x エリア)注:[図形] タブには、シグナル、合計、面積、Bkgrnd などの定量値のテーブルが表示されます。 タンパク質発現の定量化:保存されたスプレッドシート内で、得られたタンパク質のシグナルを対応するタンパク質負荷制御バンドのシグナルで割ることによって、各レーンまたは変数に対する目的タンパク質の正規化発現を計算する。注:核分画と細胞質画分を横切る正規化タンパク質の量の比較は、核分画と細胞質画分を区別するために使用される異なる負荷制御のために直接比較することはできません。しかし、個々の画分内の比較は、例えば薬物治療の後に、適切である。 パブリケーションまたはプレゼンテーション用のイメージをエクスポートする:テーブルの上にある [画像]タブをクリックし、エクスポートするイメージをクリックします。スライド プレゼンテーションまたはその他のデジタル形式でイメージを使用する場合は、ソフトウェア アイコンをクリックし、エクスポートにカーソルを合わせると、[デジタル メディア用のイメージ]をクリックします。必要に応じて、イメージを JPG、PNG、または TIFF ファイルとして保存します。