原发性慢性淋巴细胞白血病细胞的细胞次细胞分段监测核/细胞质蛋白贩运

此处描述的 CLL 患者主要样本的使用已获得苏格兰西部研究伦理服务部、NHS 大格拉斯哥和克莱德 （英国）的批准，所有工作均按照批准的准则进行。 1. 从患者血液样本中分离CLL细胞 以前同意的CLL患者的外周血样本从EDTA采血管的诊所接收，并伴有白细胞计数（WCC）。根据WCC纯化外周血CLL样本。对于 WCC < 40 x 106单元格/mL，继续执行步骤 1.1.1;对于 WCC = 40 x 106单元/mL，请继续执行步骤 1.1.2。 将所有EDTA血管的含量倒入50mL锥形离心管中，每1mL血液加入50μL人B细胞浓缩鸡尾酒。在室温 （RT） 下孵育 20 分钟。继续执行步骤 1.1.2。 使用 RT CLL 洗涤缓冲液（磷酸盐缓冲盐碱 （PBS）、0.5% 胎儿牛血清 （FBS） 和 2 mM EDTA）以 1：1 的比例稀释样品。 将Lquote RT密度梯度介质放入适合样品的圆锥形离心管中（10 mL成50 mL管，用于30 mL样品，或将4 mL插入15 mL管，用于10 mL样品）。 在RT处，小心地将样品分层在密度梯度介质和离心机顶部，在400 x g下进行30分钟。注：在将样品放入离心机之前，确保离心机处于RT位置，因为温度变化将导致单核电池富集不良，并关闭离心机的制动器，因为突然制动会干扰液体界面。 使用塑料巴斯德移液器，在密度梯度介质和 CLL 洗涤缓冲液的界面处轻轻收获收集在密度梯度介质和 CLL 洗涤缓冲液界面处的白层单核细胞，并放入新的 50 mL 圆锥形离心管中。 在隔离的单层中加入40 mL的CLL洗涤缓冲液，在RT下以300 x g清洗细胞和离心机10分钟。 丢弃上清液，通过轻拂管底部重新悬浮颗粒，然后重复步骤 1.5 中描述的洗涤步骤。 丢弃上清液，重新悬浮步骤 1.6 中所述的颗粒，然后将颗粒重新悬浮在设定的 CLL 洗涤缓冲液中（最高 40 mL，具体取决于细胞颗粒的大小）。 使用锥蓝色锥体和血细胞计对细胞进行计数。然后继续流动细胞测量，以检查CLL细胞的纯度。注：在此阶段，CLL细胞可在实验中使用的介质中培养浓度为10 x 106细胞/mL，和/或冷冻在10%二甲基硫酸盐（DMSO）/FBS中冷冻，以高达100 x 106细胞/瓶的浓度进行未来工作。 2. CLL细胞的流细胞测定 标签 12 毫米 x 75 毫米圆形底聚苯乙烯管，如表 1所述。 在管2+5中，放置一滴补偿珠子，并储存在冰上。将1μL的合适抗体（如表1所示的抗CD5、CD19、CD23或CD45）加入管2~5，在冰上孵育20分钟，通过在冰桶上放置锡箔，防止光线照射。注：这些管用作设置流式细胞测定模板的补偿控制。 将多达1 x 106 CLL细胞放入管1、6和7中，向每根管中加入2 mL的FACS缓冲液（PBS = 2S），并在RT处以300 x g离心5分钟清洗细胞。丢弃上清液，将含有细胞颗粒的管子储存在冰上。 按照表1的指示，在100μL的最终体积中，用FACS缓冲液将抗体重新悬浮到管7中的细胞中，加入适当的抗体组合。根据制造商指南，抗体以适当的浓度使用。 在100μL的FACS缓冲液中重新悬浮管2和6中的细胞颗粒。 在冰上孵育细胞，在管2和5中染色的珠子旁边孵育，20分钟免受光线照射。 孵育后，在所有管中加入2 mL的FACS缓冲液，并在RT处以300 x g离心5分钟清洗细胞。丢弃上清液，通过轻轻轻拂管重新悬浮珠子/细胞颗粒。 重新悬浮1- 5合100 μL的FACS缓冲液，并放置在冰上，直到准备好对流量细胞仪进行分析。 在使用前将DAPI溶液稀释至FACS缓冲液中的0.05-0.2微克/mL。最佳浓度可能会有所不同，建议滴定。 用100μL稀释的DAPI溶液重新悬浮管6和7，在冰上孵育管至少5分钟，使细胞染色。注：无需进一步清洗，因为 DAPI 必须存在于缓冲液中，以便死细胞保持标签。加入DAPI后，必须在4小时内对流式细胞仪上的细胞进行分析。 使用流式细胞计分析细胞。 3. CLL细胞的亚细胞分数制备 注：在规划实验设置时，包括一口未经刺激/未经处理的细胞井，从中可以生成整个细胞提取物。 使用 10 × 20 x 106细胞/条件对 MEC1 CLL 细胞系或分离的初级 CLL 细胞执行所需的刺激和/或药物治疗。然后，细胞将用于亚细胞分馏（步骤 3.4 和 3.5）或生成整个细胞提取物（步骤 3.6）。 溶液/管的制备：在分馏当天，在细胞收获之前，新鲜地准备所有溶液/缓冲液。将溶液储存在冰上，直到需要，并在4小时内使用。 PBS/磷酸酶抑制剂溶液：通过在1x PBS中稀释磷酸酶抑制剂1：20（即1x PBS的9.5 mL中0.5 maatas酶抑制剂）在PBS中制备磷酸酶抑制剂。注：确保磷酸酶抑制剂没有沉淀。如果存在沉淀物，则加热至 50°C 10 分钟。 下度缓冲液：通过在蒸馏水中稀释10倍的次吨位缓冲液（即50μL的10倍低度缓冲液，将450 μL的dH2O）稀释1：10，制备1x次低度缓冲液。 10 mM 二硫二硫醇 （DTT）： 使用蒸馏水（即，在 990 μL 的 dH2O） 中，对 1M DTT 进行 1：100 稀释，从而制备 10 mM DTT。注：DTT 是高度实验室，所以准备这个新鲜每次。避免重复的冻结/解冻循环。 完全莱沙缓冲：确定每个实验需要多少缓冲区。每个样品需要50μL的完整解酶缓冲液，因此将5μL的10 mM DTT（步骤3.2.3）添加到44.5μL的解液缓冲液中，然后加入0.5μL蛋白酶抑制剂鸡尾酒。此数量可以根据实验中的样本数进行扩展。 为新刺激细胞（步骤3.3）、新生成的细胞质分数（步骤3.4.3）、新生成的核分数（步骤3.5.3）和整个细胞进行每次刺激和/或药物治疗，标记四组1.5 mL微fuge管利萨（步骤 3.6.3）。预先冷却这些微熔管在冰上，直到需要。 在4°C下，在200 x g下离心5分钟，将细胞转移到单独标记的1.5 mL微熔管和颗粒中。去除上清液，在1mL的冰冷的PBS/磷酸酶抑制剂中重新悬浮细胞（步骤3.2.1）。在4°C下，在200 x g下通过离心将细胞进行5分钟的离心。去除上清液，并将细胞颗粒留在冰上。 细胞质馏分的制备：轻轻重新悬浮细胞颗粒，用于在50 μL的1x低氧缓冲液（步骤3.2.2）下细胞分馏。在冰上孵育细胞15分钟，使细胞膨胀。注：根据细胞数，使用的低通缓冲液的体积可以根据经验增加。 在每个样品中加入 0.8 – 2.5 μL（1：20 至 1：60）的洗涤剂，并在 10 s 的最高设置上加入涡流。 要确定用于特定细胞类型以分离核和细胞质馏物的洗涤剂的最佳浓度，请首先执行洗涤剂梯度。1：20 至 1：60（即 2.5 μL 至 0.8 μL 的洗涤剂到 50 μL 的假缓冲液）应足够。注：如果步骤 3.4 中的低氧缓冲液的体积得到调整，请确保保持适当的洗涤剂比。 在添加洗涤剂之前和之后，使用相对比显微镜观察细胞，以验证细胞分部。整个细胞看起来更大，有一个密集的，黑暗的细胞核。细胞质在细胞核周围会以明亮的光晕出现。注：通过使用西方印迹分析洗涤剂梯度产生的分馏分内的特定蛋白质，进一步证实了适当的莱沙。 一旦分离，在14，000 x g的样品在4°C下将样品离心30s。 小心地将上清液转移到预冷却、贴有标签的微熔管中。这种细胞质分数可以储存在-80°C，直到需要进一步分析。剩余的颗粒包含核分数（步骤3.5）。注：避免样品的重复冻结/解冻周期。 核馏的制备：通过上下移液，将每个核颗粒重新悬浮在50μL的完整赖沙缓冲液（步骤3.2.4）中。注：完全莱沙缓冲液的体积可根据起始单元数进行经验调整。 加入2.5μL的洗涤剂，使与核膜和涡旋相关的蛋白质溶解在最高设置10秒上。在冰上孵育样品30分钟。 涡旋在最高设置下30秒，然后在4°C下以14，000 x g离心样品20分钟。 将上清液转移到预冷却、贴有标签的微熔管中。此核馏分可储存在-80°C，直到需要进一步分析。注：避免样品的重复冻结/解冻周期。 从CLL细胞制备全细胞乳酸（WCL）注：整细胞提取物的制备可以与核馏分的制备同时进行（步骤3.5）。 通过上下移液，将整个细胞提取物颗粒重新悬浮在100μL的完整赖沙缓冲液中（在步骤3.2.4中制备），然后加入5μL的洗涤剂，以确保完整的细胞赖沙。在冰上孵育样品30分钟。 涡旋在最高设置下30秒，然后在4°C下以14，000 x g离心样品20分钟。 将上清液转移到预冷却的微熔管中。整个细胞莱沙可以储存在-80°C，直到需要进一步分析。注：避免样品的重复冻结/解冻周期。 4. 亚细胞分数的下游分析 注：在此协议中，通过西方印迹使用标准协议对生成的细胞分数进行分析，为核和细胞质分数加载相等的细胞数/通道（相当于±10 μg的蛋白质）。 核质和细胞质分数之间的蛋白质贩运的定量：通过信号强度的定量分析，或使用免费提供的西方斑点分析软件进行密度测定，以执行定量的西方污点分析。 导入图像：从不同的开发仪器生成的西方污点图像必须作为 JPG、PNG 或 TIFF 文件导入。建议使用 16 位深度 RAW 文件。要导入图像，请单击软件图标并将鼠标悬停在”导入”上。然后单击第三方图像。选择图像文件，然后单击”打开”。 显示图像：在”图像”功能区中，单击”显示”组中的”选择”按钮。”调整显示”对话框将打开以启用进一步调整（如有必要）。使用”图像 LUTs”选项卡上的可调滑块实现其他增强功能，包括亮度或对比度。 数据分析（通道取消选择）：单击”分析”功能区。要仅分析一个通道，请取消选择未分析的通道。单击”图像 LUT”中的频道的”不显示频道缩略图”，仅显示所需的频道。作为 JPG、PNG 或 TIFF 文件导入的图像可能需要取消选择多个不需要的 RGB 通道。 添加形状：要量化信号强度，请单击”添加矩形”以向图像添加矩形。单击要素的中心（例如，蛋白质带）以在要素周围放置一个矩形。或者，要手动绘制形状，请选择”绘制矩形”。添加所有所需形状后，单击”选择”将光标返回到选择工具。注：按逻辑顺序添加多个形状，因为数据按按顺序生成的 ID 号排序。 背景减法：要减去背景噪音，请单击”背景”组中的第一个按钮，然后从下拉菜单中选择”中位数”。在”背景”对话框中将边框宽度设置为 3，并选择要用于背景计算的段。选择要使用的线段时，请选择最能表示图像背景的线段。注：背景噪声会影响信号量化，因此必须减去它才能从感兴趣的形状中准确计算信号。 修剪信号和修剪背景 – 可选：以 JPG、PNG 或 TIFF 格式导入的文件可能会显示像素饱和度：蛋白质波段内的高亮区域。修剪信号和修剪背景（Bkgnd） 从分析中删除饱和像素。要查看这些值，请单击表视图右侧的”列”按钮，将修剪信号和修剪 Bkgnd添加到表中。注：像素饱和可能导致不可靠的量化。仅当形状内小于 5% 的像素饱和时，才能删除饱和像素。 导出数据：单击表格上方的”形状”选项卡。对于密度计，需要”信号”列中的值。信号是形状减去 Bkgnd 和”区域”的积的像素强度值 （Total） 的总和。单击”报告”按钮。单击”另存为”或”启动电子表格”。信号 = 总计 = （Bkgnd x 面积）注：”形状”选项卡提供一个数量值表，包括信号、总计、面积和 Bkgrnd。 量化蛋白质表达：在保存的电子表格中，通过将感兴趣的蛋白质获得的信号除以相应蛋白质载荷控制带的信号来计算每个通道或变量的感兴趣蛋白质的规范化表达式。注：由于用于区分核质和细胞质馏分的不同载荷控制，因此不能直接比较核质和细胞质馏分之间感兴趣的标准化蛋白的量。然而，在个别分数内的比较，例如药物治疗之后，是适当的。 导出图像以进行发布或演示：单击表上方的”图像”选项卡，然后单击要导出的图像。如果将图像用于幻灯片演示或其他数字格式，请单击软件图标，将鼠标悬停在”导出”上，然后单击”数字媒体的图像”。根据需要将图像另存为 JPG、PNG 或 TIFF 文件。