광물화된 조직을 연구하기 위해 색종이 마우스를 사용한 클로날 유전자 추적
Summary
이 방법은 R26R-Confetti (Confetti) 마우스 모델을 사용하여 광물화된 조직을 연구하고 번식 전략에서 이미지 획득에 이르는 모든 단계를 포괄하는 방법을 설명합니다. 모든 연조직에 적용될 수 있는 일반적인 프로토콜과 광물화된 조직에 적용될 수 있는 변형된 프로토콜이 포함된다.
Abstract
어떤 세포 유형을 발생시키고 유기체를 통해 그것의 이동을 추적하거나 그것의 장수를 결정하는 바디에 있는 개별 적인 세포를 표지하는 것은 조직 발달 및 유지의 기계장치를 드러내는 강력한 쪽일 수 있습니다. 현재 생체 내에서 세포를 모니터링하는 데 사용할 수 있는 가장 중요한 도구 중 하나는 Confetti 마우스 모델입니다. Confetti 모델은 세포 유형별 방식으로 다양한 형광 단백질을 가진 살아있는 마우스의 개별 세포를 유전적으로 표시하고 그들의 운명을 감시하기 위하여, 클론 유전 추적에게 불린 프로세스에서 시간이 지남에 따라 그들의 자손의 운명을 감시하기 위하여 이용될 수 있습니다 클론 계보 추적. 이 모형은 거의 10 년 전에 생성되고 많은 생물학 프로세스의 향상한 이해에 기여했습니다, 특히 줄기 세포 생물학, 발달 및 성인 조직의 갱신과 관련. 그러나, 다양한 형광 신호의 이미지 수집 및 동시 캡처까지 형광 신호를 보존하는 것은 기술적으로 도전, 특히 광물화 된 조직에 대한. 본 간행물은 임의의 광물화 또는 비미네랄화 조직에 적용될 수 있는 성장 판연골을 분석하기 위해 Confetti 모델을 사용하기 위한 단계별 프로토콜을 기술한다.
Introduction
세포 거동을 모니터링하는 개선된 방법은 동물 모델을 사용할 때 실험 효율을 높이는 것이 바람직하다. 생체 내에서 세포 거동을 모니터링하는 가장 유익한 방법 중 하나는 널리 사용되는 R26R-색종이(Confetti) 마우스2를포함하는 다색 리포터 마우스 균주1을이용한 클론 계보 추적이다. 형광 성 단백질로 개별 세포를 유전적으로 표시하고 시간이 지남에 따라 그 세포를 따르기 때문에, 많은 필드에 있는 연구원은 다른 생물학 시스템의 다수에 통찰력을 밝히기 위하여 Confetti 마우스를 이용했습니다.
색종이 마우스는 cre 의존DNA 재조합이 여러 가능한 형광 단백질 중 하나의 영구적인 발현을 유발하는 loxP 기반 리포터 시스템2. R26R-Confetti 알레일은 유비쿼터스 표현 CAGG 프로모터를 포함하며, 이는 loxP-측면네오 R-카세트2의바로 상류에 놓여 있으며, 그의 폴리아데닐화 서열은 전사3을종료하고, 그 다음에 무지개 2.1 구조4. 따라서, Cre-mediaed 재조합은 동시에 NeoR-카세트를절제하고 Brainbow 2.1 구성의 어느 부분이 절제되는가에 따라 특정 형광 단백질의 생산으로 이어집니다. 이 기능은 특정 Cre 변형을 사용할 수있는 마우스의 모든 셀룰러 집단을 대상으로 사용할 수 있기 때문에 색종이 마우스를 매우 적응할 수 있습니다. R26R-색종이 변형과 조직 특이적 Cre 변형의 교차는 라벨링의 특이성을 제공한다. 그러나, Cre 균주는 또한 유도할 수 있어야 한다 (예를 들어, CreERT 또는 CreERT2, 이는 그들이 핵을 입력하고 DNA 재조합을 유도할 수 있도록 타목시펜 결합을 필요로하는 5)그래서 라벨링은 지정된 시점에서 달성될 수 있다. 따라서, 세포 집단은 결과 CreERT 양성/색종이 양성 자손을 원하는 시점에서 타목시펜과 주입하여 표지하고 특정 연령으로 추적할 수 있으며, 관심 있는 조직을 분석을 위해 수집될 수 있다. 조직 처리 후, 형광 표지된 세포는 공초점 현미경검사법에 의해 직접 시각화될 수 있으므로, 각 처음에 표지된 세포의 자손은 특정 형광에 기초하여 생성된 다른 표지된 세포로부터 분리될 수 있다. 복제를 평가할 수 있도록 합니다(즉, 복제 유전자 추적).
색종이 모델의 유연성으로 인해, 그것은 건강과 질병2,6,7,8,9에서많은 다른 조직의 개발 및 유지 보수를 연구하기 위해 적용되었습니다. 10,11. 모델을 사용하는 한 가지 일반적인 방법은 세포의 특정 집단에 라벨을 부착하고 어떤 조직(및/또는 그들의 자손)에 기여했는지 확인하는 것입니다. 이 접근을 사용하여 그 같은 발견은 성숙한 이 신경교기원을가진 세포로 이루어져 있다는 것이었습니다 6. 모델의 또 다른 응용 프로그램은 줄기 세포 항상성을 연구하는 것입니다. 예를 들어, Confetti 모델은 일부 줄기 세포 클론이 줄기 세포 사이의 경쟁 중에 지배적이기 때문에 장 내 토굴에서 줄기 세포 틈새가 점차 적으로 단클론이 되는 것으로 나타났습니다2. 이 모델은 또한 세포 증식을 평가하는 데 사용될 수 있으며, 이는 천천히 분할된 세포를 연구하는 데 특히 유용합니다. 예를 들어, 관절연골(12)에서의 클론 형성을 평가하고, 5주령 마우스에서 성장판 연골세포에 대한 고슴도치 길항제의 단기 효과를13개연구하였다.
색종이 모델의 상대적 단순성에도 불구하고, 형광 신호는 특히 광물화된 조직을 분석할 때 이미지 수집 전까지 보존하기가 기술적으로 어려울 수 있습니다. 여기에서, 프로토콜은 출생 후 뼈 (생후 뼈를 가진 색종이 마우스를 사용하는 최적화된 모형을 기술합니다,) 형광성 단백질이 면역 검출을 위한 필요 없이 공초점 현미경 검사법에 의해 직접 구상될 수 있게 합니다. 이 단순화 된 프로토콜은 비 미네랄화 된 조직에 적용 될 수 있습니다. 더욱이, 적어도 3년의 장기간 형광신호를 보존하기 위해 시료를 저장하는 방법에 대한 설명이 포함되어 있다. 프로토콜의 개요는 그림 1에표시됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
색종이 모델은 광물화된 연골 조직12,13,14를 연구하고 최적화된 프로토콜을 설명하기 위해 광범위하게 사용되었다. R26R-색종이 알레일의 사본 1개 또는 2개의 사본이 있는 색종이 마우스2는 사육 및 실험에 사용될 수 있다. Brainbow 2.1 구성의 한 대틀로 마우스를 재결합하면 적색 형광 단백질 (RFP, 세포질), 황색 형광 단백질 (YFP, 세포질), 청록색 형광 단백질 (CFP, 막 국소화) 및 녹색의 네 가지 잠재적 인 라벨을 제공합니다. 형광 단백질 (GFP, 핵 국소화), 동형 색종이 마우스 (즉, Brainbow 2.1 구성의 두 사본을 포함)에서 재조합하는 반면, 10 가능한 색상 출력을 제공합니다 (RFP + RFP, RFP + YFP, RFP + GFP, YFP + YFP+ GFP, CFP + CFP, CFP + GFP, GFP + GFP). 그러나, DNA 절제 및 반전 사건이 스토카방식으로 발생하기 때문에, GFP를 생성하기 위한 재조합은 이전에 보고된 바와 같이 세포의 극히 일부에서만 발생하며,2를사용하였고, 세포형 또는 Cre 라인에 의해 겉보기에 다르다2. 12,13. 따라서 GFP 발현으로 이어지는 재조합 이벤트의 발생이 낮다는 점을 감안할 때, 6가지 색상 출력은 동형색종이 쥐에서 가장 일반적이다.
색종이 마우스로 실험을 계획할 때 중요한 고려 사항은 적합한 Cre 변형을 찾는 것입니다. 첫째, 색종이 알레일여러 loxP 사이트를 가지고 있기 때문에, 하나의 재결합 이벤트는 두 번째4를배제하지 않습니다. 즉, 세포가 표지되고 분할되어 한 색상의 복제본을 생성하면 딸 셀 중 하나에서 두 번째 재결합 이벤트가 다른 색상을 생성하여 진정한 클론 확장을 마스킹합니다. 따라서 해당 프로모터가 활성화되면 효소가 항상 활성화되는 비 유도성 Cre 균주는 권장되지 않습니다. 둘째, 일부 균주에서 는 Cre 재조합의 발현은 종종 내인성 단백질의 희생으로 제공되어, 그로 인하여 자체의 표현형을 생성한다(예를 들어, 생쥐가 2개의 Cre alleles15를품고 있는 Prg4-GFPCreERT2노크인 마우스 균주에대해), 그래서 Cre 알레일의 단일 사본이 바람직하다. 기재된 모든 실험에서, Col2CreERT16의 단일 사본은13에기재된 바와 같이 Col2CreERT:Confetti 마우스를 생성하기 위해 남성 또는 여성 부모에 의해 수행되었다. 다음으로, 관심 있는 세포 유형에 대한 Cre 라인의 특이성은 중요한 고려 사항이다. 예를 들어, Col2CreERT는 연골 세포 특이적이지만 초기 출생 후 연골17에서연골 세포의 여러 뚜렷한 집단을 표시합니다. 마지막으로, 상이한 Cre 균주의 활성은 동물 나이에 따라 상당히 변화할 수 있으며, 동일한 유형의 세포에서도 Cre 발현 변화에 활용되는 프로모터의 내인성 활성이 증가함에 따라 상당히 변화할 수 있다( 예를 들어,Prg4-GFPCreERT2) 타목시펜 투여량의 수는15세()로피상적 지대 세포에 라벨을 붙인다.
표지된 세포의 수는 주어진 타목시펜의 양에 의해 반영될 것이므로, 클론을 서로 구별하기 어렵기 때문에 항상 최대 용량을 부여하는 것이 바람직하지는 않다. Cre 발현은 나이뿐만 아니라 다른 프로모터의 조절에 따라 달라질 수 있기 때문에, 타목시펜 투여량은 라벨링을 최적화하기 위해 조정되어야 할 것이다. 재조합이 발생하고 그 결과로 생긴 형광 단백질이 이미징을 위해 충분히 축적되기 위해서는 시간이 필요하기 때문에 세포가 재조합을 트리거하는 즉시 형광되지 않는다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. Cre 라인, 세포 유형 및 동물 연령에 의해 영향을 받는 것으로 보이는 광범위한 시간(24-72시간 사이)이 필요합니다. 타목시펜은 투여 후 오랫동안 생물학적활성이 가능하기때문에(18)은 항상 각 모델에서 재조합 효율을 철저히 확인하는 것이 바람직하다.
공초점 현미경 검사법 단계 도중, 색종이 형광 성 단백질의 흥분은 레이저 빛에 의하여 조직의 침투를 요구합니다. 다른 조직은 다른 특성을 가지고 있기 때문에, 레이저 빛은 모든 조직의 160 μm 두꺼운 섹션을 관통하지 않을 수 있습니다. 그러나, 이러한 두꺼운 섹션은 도 2,도 3에사용되는 바와 같이 성장 판 연골을 사용할 수 있습니다. 모든 현미경은 서로 다르며 설명된 설정(보충파일 1)이사소한 조정 없이 완벽하게 작동할 가능성은 거의 없습니다. 주요 과제 중 하나는 다른 형광 단백질을 구별하여 한 채널에서 다른 채널로 오염이 없도록 하는 것입니다. 예를 들어, GFP로부터 오는 형광에 의해 야기된 YFP 채널의 신호는 YFP와 RFP 채널 사이에 중첩됩니다. YFP 및 CFP 채널도 신중하게 확인해야 합니다. 이 작업은 여러 가지 방법으로 수행할 수 있습니다. 첫째, 각 형광 단백질에 대해 기록되는 형광광 파장의 방출 범위를 좁힐 수 있다. 둘째, 디지털 게인과 함께 레이저 전력을 조정하면 신호를 최적화할 수 있다. 이 연구에서 이 단계는 충분했습니다, 그러나 강한 형광 신호에 의존합니다. 이것은 이론적으로 비효율적인 조직 처리가 형광 단백질의 활성을 감소시킬 수 있거나 약한 레이저 광원이 채널 분리를 손상시킬 수 있음을 의미합니다.
Confetti 마우스의 장점 중 하나는 클론 역학에 대한 특정 유전자의 영향을 연구 할 수 있도록 사용할 수있는 많은 수의 유전자 돌연변이 균주와 결합 될 수 있다는 것입니다10,11,12 ,13,14,19,20, 일부 제한 사항이 기이하지만. 예를 들어, 색종이 대립 유전자와 관심 유전자의 재조합은 클론 계보 추적과 결합된 Cre loxP 기반 돌연변이체를 사용할 때 분리될 수 없다. 그럼에도 불구하고, 이러한 일치하는 재조합 이벤트는10,14,20일유효할 수 있다. 예를 들어, 이러한 가능성은 생후 연골세포-성장판(21)에서 TSC1의 산후 연골세포 특이적 절제에 따른 마우스의 휴식 구역에서 증가된 세포 수를 탐구하는 데 사용되었고, 시간이 지남에 따라 이들 세포 들 사이의 클론 관계를 밝혀 13. 추가적으로, 색종이 마우스를 이용한 조직 특이적 클론 분석은 비-Cre loxP 계 돌연변이마우스(11)와함께 사용될 수 있으며, 이러한 접근법을 약리학적8,9와 결합하는 것도 가능하다. ,13 및 / 또는 수술 모델8은 다른 기능 적 섭동에 대한 클론 반응을 시각화합니다. 면역 형광에 의한 내인성 단백질의 면역 검출과 색종이 표지 된 섹션을 결합 할 때 추가 기회가 발생합니다. 이러한 분석은 추적 된 세포와 알려진 마커와의 동국화를 식별 할 수 있습니다. 본 명세서에 기재된 고정 방법을 사용하면, 면역형광을 실시하고 여전히 색종이형광단백질(12,13)으로부터의형광을 가시화할 수 있다. 그러나, 언급 된 논문에서, 항원 검색이 필요하지 않았다. 구연산염 완충액에서 끓는 것과 같은 가혹한 항원 회수 방법은 색종이 형광의 완전한 손실로 이끌어 냅니다. 색종이 형광 단백질은 항체22를사용하여 검출될 수 있지만, 클론 정체성의 손실이 발생할 수 있다.
요약하자면, 색종이 모델을 사용하여 생체 내 세포에 라벨을 붙이는 것은 시간이 지남에 따라 해당 세포의 운명을 분석하는 유익한 도구입니다. 기술된 방법은 광물화된 조직에서 형광 단백질 발현을 직접 시각화하는 빠르고 효율적인 방법을 제공한다.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 방법론적 조언에 대한 예브게니 이바슈킨 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 스웨덴 연구위원회 (A.S.C),러시아 과학 재단 (ASC에 #19-15-00241 부여), 카롤린스카 연구소 (A.S.C.), 스트랫 레겐 KI와 스티프 텔 센 Konung 구스타프 V : 80-årsfond (A.S.C.), Stiftelsen에 의해 재정적으로 지원되었다 프리무라레 반후셋과 살스카펫 바르나바드(P.T.N.), 중국 장학금 위원회(B.Z.). 공초점 현미경은 너트와 앨리스 월렌버그 재단에 의해 투자되었다.
Materials
| 2,2-thiodiethanol | Sigma | MKCF9328 | |
| 60 mm-long cover slips | Mendel-Gläzer | 220588 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | |
| Cryomold (standard) | Sakura | 4557 | |
| Cryostat | Thermo | Model: NX70 | |
| Disposable cryostat blades | Histolab | 207500014 | Specifically for use with hard tissue |
| EDTA | Scharlan | AC0960005P | |
| Formaldehyde concentrate | Merck | 8.18708.1000 | |
| Glass bottles | Sigma | V7130 | Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing |
| Imaris software | Oxford Instruments | N/A | Image analysis software for 3D reconstruction |
| Isoflurane | Zoetis | 11-8162 | |
| OCT | Sakura | 102094-104 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| PBS | Gibco | 14200075 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1.06498.1000 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost UltraPlus slides | Mendel-Gläzer | J3800AMNZ | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Zen2 software | Zeiss | N/A | Freeware for Confocal laser scanning microscopy |
Riferimenti
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