成人大鼠心脏解剖与功能的超声心动图评估
Summary
本研究提出了一种非侵入性方案，用于心脏解剖和成年大鼠心脏解剖功能的跨胸超声心动图评估。详细研究了心脏瓣膜、四个心脏室和上升主动脉、主动脉拱和下行主动脉。
Abstract
实验动物模型的使用在心血管科学中变得至关重要。大多数使用啮齿动物模型的研究都集中在二维成像上，以研究左心室和 M 模式回声的心脏解剖结构，以评估其尺寸。然而，这可能限制一项全面的研究。在这里，我们描述了一个协议，允许评估心脏室大小，左心室功能（收缩和舒张）和瓣膜功能。该协议使用了传统的医用超声机，通过左半月窗、顶窗和超视窗获得不同的回声视图。在左半截面窗口，获得长轴和短轴，以分析左室尺寸、右心室和肺动脉尺寸，以及斜线、肺和主动脉瓣功能。心形窗口允许测量心室尺寸和评估收缩和舒张参数。它还允许多普勒评估与检测和量化心脏瓣膜干扰（回流或狭窄）。左心室的不同段和墙壁在所有视图中都可视化。最后，上升主动脉、主动脉拱门和下行主动脉可以通过上端窗口进行成像。获得超声成像、多普勒流和组织多普勒评估的组合，以研究心脏形态和功能。这是一个重要贡献，以改善评估成人大鼠的心脏功能，影响研究使用这些动物模型。
Introduction
心血管疾病是欧洲的主要死亡原因，尽管近年来在治疗、诊断和监测方面取得了进展，但每年导致400多万例死亡。快速的技术发展促进了心血管病人护理的进步。在这些诊断工具中，生物医学成像受到特别关注，它允许以非侵入性方式进行解剖学和功能评估。同样，医学也受益于生物医学研究的结果。实验动物模型对于测试从临床环境衍生的假设和开发创新疗法4，5非常有用。
人们越来越关注使用超声心动图作为实验动物模型的研究工具，从而允许在纵向研究中从单个动物获得多个测量值。需要注意的是，使用鼠类或啮齿动物模型有一些优点。孕期短，繁殖和住房成本低，他们的基因组知识和开发转基因动物的可能性是这些物种的主要优势，使它们对研究心血管疾病的机理有吸引力。虽然大鼠和小鼠模型显示出类似的优势，但大鼠是心血管研究中的经典选择，因为它们的物理尺寸较大，心率较低，在超声心动图研究中提供了更好的图像4，5，6，7，8，9，10。
我们使用传统的医疗超声设备描述一种超声心动图协议，使用 Wistar 大鼠评估心脏室和心脏瓣膜（解剖和功能）。这是一个简洁和完整的协议，用于短时间采集图像和循环，允许离线测量，以后可以修改，以集成新的变量或测量值随时间变化。
Protocol
所有动物程序均按照指令2010/63/EU进行。这些程序由机构动物福利机构批准，由葡萄牙动物保护主管当局DGAV许可（许可证号0421/000/000/2018）。注：使用来自查尔斯河实验室（12-16周大）的女威斯塔·汉IGS（Crl：WI（汉族）。该协议是特定于大鼠，独立于其应变，年龄或性别。 1. 为回声心电图准备大鼠：麻醉和回归协议 称量老鼠。 根据大鼠体重，制备由中子兰（4.76毫克/千克）、麦地霉胺（0.356毫克/千克）和芬太尼（0.012毫克/千克）组成的三组分麻醉剂。 注射麻醉内腹。检查没有踏板退退反射，以评估麻醉的深度。 从躯干区域洗头发。 在双眼上涂上耐用的凝胶，防止硬化干。 将麻醉大鼠置于加热垫顶部的苏皮位置，以保持体温（37.0 °C = 0.5 °C）。 在胸部涂上一层预热（接近体温）超声波凝胶，主要在心脏覆盖的区域。避免凝胶中的气泡干扰超声波成像。 在超声心动图结束之后，立即使用阿提帕美酮（0.94毫克/千克）和氟马泽尼（0.2532mg/kg）进行皮下注射逆转麻醉。注：这种麻醉组合提供长达45分钟的超声心动图成像。下面描述的超声心动图协议与任何其他麻醉方案兼容。 2. 回声心动图 注：超声心动图使用传统的临床超声心动图设备进行，带12兆赫心脏探头，包括半遮阳伞（长轴和短轴视图）、表观（4、5、2和3腔）和超端视图中采集的静止图像和循环。记录心电图，以识别端扫描和端片，用于测量程序和环路采集（ECG触发）11，12。预设用于保持大鼠之间的图像定义稳定：频率 5-10 MHz、深度 2.5 厘米、帧速率 125 fps、多普勒样本 1.0 mm 和彩色多普勒混叠速度 40 厘米/s。 循环记录至少 3 次心跳。 左护栏长轴视图注：将探头放在胸骨左侧，索引标记转向右肩。 在主动脉阀、斜面阀传单和左心室中腔（斜面阀尖端或线水平处的光标）1、2、3、4处记录M 模式图像。M-Mode光标应垂直于兴趣1、3、10的结构。 记录所有视图的 2D 循环。 在左心室流出区使用变焦记录 2D 循环。 在主动脉和斜面阀上同时记录带彩色多普勒成像的 2D 循环。 左半轴短轴视图注：将探头放在胸骨左侧，索引标记旋转到左肩。 通过稍微倾斜探头，获得主动脉阀水平处的图像。 记录所有视图的 2D 循环。 在主动脉和肺瓣膜上同时记录带彩色多普勒成像的二维循环。 在肺动脉获取光谱脉冲多普勒图像。光标应与流1、3平行。 通过将探头稍微向下倾斜，获取毛细血管肌肉水平左心室的图像。 记录所有视图的 2D 循环。 锥形 4 室视图注： 将探头放置在前axill线中的尖角区域，索引标记转向左肩。 记录所有视图的 2D 循环。 记录包括所有4个腔室在内的2D和组织多普勒成像循环。 关注左心室。 在左侧中庭使用缩放记录 2D 循环。 在斜面阀和左中庭记录带彩色多普勒成像的 2D 循环。 记录左侧心室传播流的同步 M 模式和彩色多普勒图像。 在斜面阀处获取光谱脉冲波 （PW） 多普勒，用于左心室流入。将样品放在斜面传单提示处，放在完全打开的舒张位置1，2，3，11，12。 在斜面阀处添加连续波 （CW） 多普勒图像（如果存在斜面阀回流）。 在斜面环形图（左心室侧壁和隔膜壁）处获取光谱脉冲组织多普勒图像。将 PW 多普勒光标与心脏的长轴对齐，以产生最大多普勒信号1、2、3、13。 记录斜面环形的 M 模式，用于斜面环形平面收缩偏移测量（左心室壁侧光标）。 关注右心室。 在右中庭使用缩放记录 2D 循环。 在三角阀和右心房记录带彩色多普勒成像的 2D 循环。 在三角环状（右心室壁）处获取光谱脉冲组织多普勒图像。 通过将 2D 光标置于三脚侧环形，记录三角环状斜面收缩偏移 （TAPSE） 的 M 模式。 锥形 5 室视图注：从 4 室视图中，将探头稍微前倾斜到胸部。 记录所有视图的 2D 循环。 在主动脉阀和左心室流出区记录带有彩色多普勒成像的二维循环。 获取左心室流出道的光谱脉冲波多普勒图像。将光标与流动平行放置，并将样品放在左心室流出区4、14处。 获取左心室中腔处的光谱脉冲波多普勒图像，用于同时左心室流入和流出波。 在主动脉阀处获取光谱连续波多普勒图像。横流记录在基线以下，如果存在，则记录在基线以下。 锥形 2 室视图注：返回 4 室视图，逆时针旋转探头 90°。 记录所有视图的 2D 循环。 在斜面阀处记录带彩色多普勒成像的 2D 循环。 锥形 3 室视图注：轻微倾斜探头。 记录所有视图的 2D 循环。 在主动脉和斜面阀上同时记录带有彩色多普勒的 2D 循环。 苏普拉斯特纳尔窗口注 在垂直的左侧，探头向下 记录主动脉拱门的二维循环。 获取上升主塔处的光谱脉冲波多普勒图像。 获取光谱脉冲波多普勒图像在下降主塔。 3. 测量 继续测量，包括全球纵向应变。离线执行这些测量，以减少麻醉时间。
Representative Results
图 1显示了探头在胸部的位置，以显示护栏窗口长轴视图 （图 2）。此视图允许精确测量左心室腔和壁厚、收缩功能（图 3）、左心室流出直径（适用于其他公式，如心脏输出）、上升主心直径和左中庭直径。所有腔室尺寸都与体重挂钩。护尾长轴视图允许对主动脉和斜面阀进行解剖（带 2D-Echo）和功能（带彩色多普勒成像）评估。此视图还允许识别和测量包外输液（如果存在）。M-Mode 可用于左心室测量（图 3）：隔膜和后壁尺寸、左心室尺寸、左心室收缩功能和左心室质量1、3、4、10、14。 左心室收缩功能通过小数缩短以及通过可视化心脏周期期间壁的偏移和增厚（由心电图评估）进行评估。左心室质量通过公式获得：LV 质量 = 0.8 x 1.04 x （IVS + LVID = PWT）3 – LVID3|（IVS：中间的隔膜厚度;LVID：左心室内径;PWT：后壁厚度，测量在端直径）1，3，4，10，14 。 图 4显示了探头在胸部的位置，以显示护栏窗口短轴视图。此视图允许可视化右心室流出、主动脉瓣、肺瓣、肺动脉（图 5）和左心室中腔尺寸（图 6）和功能（带段收缩力的 2D 可视化）1、3、4、10、11 。 图 7显示了探头在胸部的位置，以显示可看视图。在四室视图（图8）中，可以评估所有4室尺寸（所有4室的面积和左心室的体积）和功能。也可以评估斜面和三头肌瓣的解剖和功能表征。左心室流出，主动脉流量和上升主动脉通过锥形5室视图获得。2室视图 （ 图9） 侧重于左心房和心室大小和功能.锥形 3 室和 5 室视图允许主动脉瓣和左心室流出评估。所有视图相结合，允许评估不同的左心室壁和部分，并研究不同的收缩和舒张函数参数1，3，4，10，11。 左心室舒张功能可以通过在斜面瓣膜（图10）的脉冲多普勒成像（图10），左心室的等量松弛时间，以及组织多普勒成像在斜面环1，3，12评估。正常斜面流入由从左心房到左心室的双相流组成。在正常情况下，早期流与 E 波重合高于心房收缩（A 波）的后期流。 左心室舒张功能也可以研究组织多普勒成像，分析心肌速度（图11）。光谱组织多普勒成像研究收缩和舒张功能在心脏周期，有3个峰值：一个正收缩峰（s’波）代表心肌收缩和两个负舒张峰（e’波早期舒张心肌放松和’波活动性心萎缩在晚期直径）评估， 从隔环或侧环1，3，4，10，14。 通过脉冲多普勒成像在斜面阀和在斜面环形图的组织多普勒成像对左心室舒张功能的表征应包括以下参数：E波速度、A波速度、E/A比、e’速度、A’速度、E/e 比和E波1、3、4、10、14的减速时间。 左心室收缩功能可以通过斜面环形平面收缩偏移测量、小数缩短（图3）、喷射分数、中风体积、心脏输出、收缩组织波速（图11）和全球纵向应变（图11）进行研究，通过心肌变形与应变率分析（图12）1、3、4、10。 喷射分数通过修改后的辛普森方法计算，该方法基于使用 apical 4 和 2 腔视图对血液和组织界面的视觉跟踪。在基底或斜面阀水平，通过连接斜线环的两个相反部分与直线1，3，4，10闭合轮廓。形成喷射分数的血液量表示中风体积。如果斜线瓣膜是胜任的，那么这可以乘以心率来计算心脏输出1，3，4。中风量基于心脏周期期间通过左心室出口道的血流量，使用以下公式：SV = x （LVOT 直径 /2）2 x VTI （LVOT）（LVOT：左心室流出道;LVOT 直径在半截面长轴视图中测量。VTI（LVOT）：速度时间积分从脉冲波多普勒在LVOT在aical 5室视图）1，3。 最常用的基于应变的LV全球收缩函数测量是通过心肌变形与应变率分析1、3、4、10获得的全局纵向应变。它通常通过斑点跟踪超声心动图进行评估，其中全球纵向应变的峰值描述了终发和端丝虫之间的 LV 心肌的相对长度变化：GLS（%） = （ML = MLd）/MLd（MLs：末端的心肌长度;MLd：在末期诊断时心肌长度）。 测量应从 atoical 3 室视图开始，以可视化主动脉阀关闭，在光谱多普勒成像或主动脉瓣打开和关闭在 M 模式成像1、3、4、10上主动脉瓣的打开和关闭。还将评估 4 室和 2 室视图，并对所有三个视图的测量值进行平均。右心室收缩功能通过三元环状环状环状偏移（TAPSE）和组织多普勒成像在三元环状进行评价。所有阀门均通过彩色多普勒成像进行研究，允许直接可视化狭窄或回流（图13）。如果存在主动脉瓣回流，可以通过连续多普勒成像（图14）15研究和量化。图 15显示了上端窗口中可视化的升序道、主动脉拱和前端下降主动脉。 图1：用于截瘫长轴视图的探头定位。请点击此处查看此图的较大版本。 图2：左中庭（LA）、左心室（LV）、主动脉瓣、上升主动脉（Ao）和斜面瓣膜（MV）的2D截瘫长轴视图。请点击此处查看此图的较大版本。 图3：具有测量值的左心室的M-模式，包括采用直径（IVSd）的间间隔膜厚度、直径（LVIDd）和硅片（LVIDs）中的左心室内径、后壁厚（LVIPWd）、小数缩短（%FS）、用Teteichz方法计算的喷射分数[EF（Teich）]， 左心室质量 （LVdMass），腹腔厚度 （EPR） 和左心室质量与计算适应啮齿动物 （LVM 鼠标）.请点击此处查看此图的较大版本。 图 4：用于截瘫短轴视图的探头定位。请点击此处查看此图的较大版本。 图5：主动脉瓣（Ao）、左中庭（LA）、右中庭（RA）、右心室（RV）和肺动脉（PA）的2D半身半轴短轴视图。请点击此处查看此图的较大版本。 图6：左心室毛细管肌肉水平处的半轴短轴视图。请点击此处查看此图的较大版本。 图 7：探头定位，用于 4 室视图。请点击此处查看此图的较大版本。 图 8：2D 4 室视图，包括左心室 （LA）、左心室 （LV）、右心房 （RA） 和右心室 （RV）。请点击此处查看此图的较大版本。 图 9：2D 回波的锥形 2 室视图，包括左心房 （LA）、心室 （LV） 和斜面阀 （MV）。请点击此处查看此图的较大版本。 图10：斜面阀处的脉冲波多普勒，显示E波速度=0.49米/秒，A波速度=0.33米/秒，E波减速时间=35 ms，E/A比率=1.48。请点击此处查看此图的较大版本。 图11：在隔膜环状环状的光谱多普勒组织，显示心肌组织波的直径（e’和a’）和systole（s’）。请点击此处查看此图的较大版本。 图12：在4室视图下评估的纵向应变心肌变形分析。请点击此处查看此图的较大版本。 图13：使用彩色多普勒进行主动脉回流的可视化。请点击此处查看此图的较大版本。 图14：主动脉瓣连续多普勒在5室视图处，显示基线上方的回流，半压时间测量为95 ms。 图15：上升主动脉（Asc）、主动脉拱（拱）和下降主动脉（Desc）的苏普拉斯特恩视图。请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
该协议允许使用传统的医学超声设备和成人大鼠的高频探头进行完整的超声心动图研究。这是协议的一个重要方面，因为专用于小动物的超声波设备昂贵，而且投资并不总是合理的。
由于纵向成像研究需要反复麻醉，本议定书中提出了麦地霉素-米达索兰-芬太尼的组合，因为与威斯塔大鼠中的亚氟兰或氯胺酮-西拉辛混合物相比，它更适合连续使用。然而，建议的超声心动图方案是兼容任何其他麻醉协议16。如上所述，我们的超声心动图协议包括评估几个参数，以便识别解剖学和功能性心脏变化。
专注于解剖表征，可以评估所有心室的尺寸及其扩张，左心室肥大，瓦面纤维化或钙化。关于心脏功能，可以分析左心室收缩和舒张功能以及右心室收缩功能1、3、4。此外，还研究了心脏瓣膜的解剖和功能，使用2D-回波进行解剖表征（识别纤维化、钙化或异常开口），并使用多普勒成像进行功能表征和狭窄或回响检测。彩色多普勒成像能够检测流动方向和湍流，光谱多普勒波允许测量速度和梯度1，3。
几乎所有大鼠都获得了足够的图像质量（最小重量为200克），尽管由于解剖学的个体间差异，在大鼠之间可能没有完全相同的定义获得超声心动图视图，这可能对腔体尺寸测量产生影响。左心室M模式测量有5%的观察者报告变异性17。特别是，当使用 M-Mode 进行左心室测量时，可能存在以下限制：难以获得垂直角度;只包括基底段（导致在存在不对称肥大或区域收缩功能障碍的情况下测量不准确）;和几何假设（考虑到左心室是一个前列腺椭圆体，其长/短轴比为2：1，肥肥的对称分布）。此外，包含立方体测量可能会影响精度，因为即使尺寸的微小误差也可能导致质量被高估1、3、10。即使使用辛普森方法计算的体积和弹出分数，也有缺点：顶点经常被缩短;内皮退位可以偏置测量，并盲目的形状变形，没有在apical 4和2室视图1，3，10可视化。
重要的是，该协议突出了使用先进的测量和评估，如左心室应变和应变率，通过斑点跟踪评估，以实现关于心肌纤维行为1，3的更完整的信息。为了进行更精确的应变和应变率评估，需要优化图像质量、最大化帧速率和最小化顶点前缩短。中壁全球纵向菌株的使用，因为它同意更多的公布可用数据，并已在一些临床研究显示是健壮和可重复的10。设备中集成的心电图监测极易产生伪影，这是一个制约因素。此外，必须指出，大鼠的功能或血液动力学心脏状态可以取决于变量，如温度，血压和心率4，5，6，7，8，9，13，14，17。
由于分辨率与探针频率相关，未来的发展有望在小型动物的非侵入性心血管成像中开发更高的频率探头，从而获得更高的分辨率和图像定义，设备。方法和测量的标准化被认为是这一研究领域的关键，可以更精确地诊断实验大鼠模型的超声心动图，从而更好地了解人类心血管的分子生物学疾病。
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ARSP和ATP分别由SFRH/BD/121684/2016和SFRH/BPD/123181/2016年研究金支持。
Materials
| 12S-RS Probe | GE Medical Systems | H44901AB | |
| Antisedan (5 mg/ml) | Esteve | P01B9003 | |
| EKG monitoring unit | GE Medical Systems | N/A | |
| Electrodes | FIAB | F9089/100 | |
| Fentanilo (0.05 mg/ml) | B.Braun | BB3644960 | |
| Flumazenilo (0.1 mg/ml) | Generis | MUEH5933080 | |
| Insuline Syringe 1ml | SOL M | 1612912 | |
| Lubrithal gel (10mg) | Dechra | NC519 | |
| Medetor (1 mg/ml) | Vibarc | P01B0308 | |
| Midazolan (5 mg/ml) | Labesfal | MUEH5506191 | |
| Shaver Razor AESCULAP Isis GT608 | Braun | 90200714 | |
| Small Animal Heated Pad 120volts | K&H Manufacturing inc. | 655199010608 | |
| Ultrasound Gel | Parker Laboratories | REF 01-08 | |
| Ultrasound machine | GE Medical Systems | VIVID T8 | |
| Underpads | Henry Schein | 900-8132 |
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Citazione di questo articolo
Ribeiro, S., Pereira, A. R. S., Pinto, A. T., Rocha, F., Ministro, A., Fiuza, M., Pinto, F., Santos, S. C. R. Echocardiographic Assessment of Cardiac Anatomy and Function in Adult Rats. J. Vis. Exp. (154), e60404, doi:10.3791/60404 (2019).