유세포 측정을 사용하여 인간 백혈구에 의한 아스퍼질러스 훈증 코니디아의 식세포증 측정
Summary
이 프로토콜은 유세포측정법을 사용하여 인간 1차 식세포에 의한 아스퍼질러스 훈증의 식세포증을 정량적으로 측정하고 단순한 유착에서 백혈구로의 식세포증을 구별하는 빠르고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
Abstract
곰팡이 아스퍼질러스 훈증에 의한 침습성 폐 감염은 면역 손상 환자에게 큰 위협이 된다. 흡입한 곰팡이 코니디아 (포자)는 선천적 단핵구 및 / 또는 호중구에 의해 식세포가 함유되어 인간의 폐 폐포에서 제거됩니다. 이 프로토콜은 인간 백혈구와 공동 인큐베이션및 내부화 및 세포 부착 코리디아의 차별을 허용하기 위해 항 FITC 항체와 후속 카운터 염색을 위해 플루오레세인 이소티오차네이트 (FITC)를 사용하여 유세포증에 의한 식세포증의 빠르고 신뢰할 수있는 측정을 제공합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 그것의 급속성, 관심있는 다른 세포 마커의 세포 분석과 분석, 단일 샘플에서 단핵구 및 호중구의 동시 분석 및 다른 세포 벽 베어링 곰팡이 또는 박테리아에 대한 적용 가능성과 분석을 결합 할 수있는 가능성입니다. 식균 백혈구의 백분율의 결정은 병원체의 독성을 평가하거나 병원체 야생 유형 및 돌연변이를 비교하기위한 미생물학자뿐만 아니라 병원균에 대처하기 위한 인간 백혈구 능력을 조사하기위한 면역 학자에게 수단을 제공합니다.
Introduction
침습성 폐 아스퍼질로시스는 치료 옵션이 제한되어 있고 조기 진단시성공으로 면역 손상 환자에게 큰 위협이 되며, 이는 높은 사망률1을이끈다. 감염제는 대부분의 서식지에 유비쿼터스 인 곰팡이 아스퍼질러스 훈증의 코니디아 (포자)입니다2. 코니디아는 흡입되고 기도를 통과하고 마침내 폐 폐포에 들어갈 수 있습니다. 면역 적격 인간에서, 이들 코니디아는 단핵구 또는 대식세포 및 호중구 과립구와 같은 선천적 면역 세포에 의해 제거되며, 이는 병원체를 (식균) 및 소화한다3. 식세포증은 숙주 병원체 상호 작용에 관심이 있을 때 미생물학자와 면역학자에게 도 마찬가지로 중요합니다. 백혈구 및 코니디아의 공동 배양과 같은 대립 성 애세포는 종종 플루오레세인 또는 그 유도체 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)에 의한 포자의 라벨링을 포함합니다. 현미경을 사용하여, 이 접근은 번거롭고 현실적으로 세포의 수백에 제한되더라도, 내면화한 형광 콘idia를 확인하고 부착된/부착된 코니디아를 결정하는 것은 간단합니다4. 그러나, 쉽게 분 이내에 세포의 수십만의 분석을 허용 유세포 분석, 식균 및 부착 코니디아의 차동 염색은 필수적이다. 따라서 많은 프로토콜은 Trypan Blue에 의존하여 부착 코니디아5,6,7,8에서FITC 형광을 담금질합니다. 또 다른 접근법은 에티듐 브로마이드 및 FITC의 형광 공명 에너지 전달을 이발하여 부착코니디아9,10,11에서녹색 형광 대신적을 방출한다. 특정 항체가 이용 가능한 경우, 일부 박테리아의 경우와 마찬가지로, 세포 결합 입자는12,13을직접 염색할 수 있다.
여기에서, 우리는 세포에 포자의 부착및 상호 작용의 부족과 더불어 인간 백혈구에 의한 FITC 표지된 A. fumigatus conidia의 식균증을 신속하고 정량적으로 평가하는 프로토콜을 제시합니다(APC)-결합된 항체. 이 방법은 또한 동일한 샘플에서 단핵구 및 호중구에 의한 식세포증의 개별 분석을 위해 사용될 수 있는 추가 세포 마커의 동시 유동 세포 분석법을 허용한다.
프로토콜은 곰팡이 균주의 특성화 (예를 들어, 여기에 제시 된 무코랄레스 속의 아스퍼질러스 및 기타 곰팡이의 여러 종) 및 그들의 돌연변이체14 및 면역 손상 된 개인의 백혈구와 같은 식세포에 대한 면역 학적 연구에 적용 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 일반적인 현미경 프로토콜에서 불가능한 많은 수의 1차 인간 백혈구와 A. fumigatus conidia의 상호작용을 측정하는 빠른 유동 세포 측정 방법을 제시한다. 현미경을 가진 화상 진찰 세포및 수동내재된 conidia를 계수하는 것은 번거롭고 현실적으로 수백 개의 세포에 대해서만 행해질 수 있습니다. 유세포측정은 몇 분 안에 수천 개의 세포를 측정하여 이 문제를 극복합니다. 두 접근?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 훌륭한 기술 지원을 위해 부인 피아 Stier에 감사드립니다. M. 폰 Lilienfeld-Toal은 패혈증 제어 및 관리 센터 (독일 연방 교육 보건부, BMBF, FKZ 01E01002) 및 감염성 Gnostics tics 연구 캠퍼스 (BMBF, FKZ 13GW0096D)에 의해 지원됩니다. 티 응옥 마이 호앙은 미생물 통신의 예나 학교에 의해 지원됩니다 (도이치 포르충스게마인샤프트, FKZ 214/2)
Materials
| Adhesive foil | Brand | 701367 | |
| anti-CD14 V500 | BD Biosciences | 561391 | clone M5E2 |
| anti-CD45 BUV395 | BD Biosciences | 563792 | clone HI30 |
| anti-CD66b PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 562254 | clone G10F5 |
| anti-FITC APC | ThermoFisher Scientific | 17-7691-82 | clone NAWESLEE |
| Cell culture plate, 12-well | Greiner Bio-one | 665180 | |
| Cell scraper | Bioswisstech | 800020 | |
| Cell strainer, 30 µm | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | SmartStrainer |
| Cytometer | BD Biosciences | LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red) | |
| Detergent | Sigma Aldrich | P1379 | Tween 20, 0.01% in PBS |
| Drigalski spatula | Carl Roth | PC59.1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED3SS-500g | 2 mM in PBS |
| Erythrocyte lysis buffer | 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | 10% in RPMI 1640 |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) | Sigma Aldrich | F3651-100MG | 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution |
| Formaldehyd | Carl Roth | PO87.3 | Histofix |
| Malt agar (1.5%) | malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes | ||
| Na2CO3 | Carl Roth | 8563.1 | 0.1 M in PBS |
| Petri dish | Greiner Bio-one | 633180 | |
| Phosphat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 189012-014 | without Calcium, without Magnesium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 61870010 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement |
| Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | MACSmix Tube Rotator |
| Round-bottom tube, 7.5 mL | Corning | REF 352008 | |
| Software for data acquisition and analysis | BD Biosciences | FACSDiva 8.0 | |
| V-bottom plate, 96 well | Brand | 781601 | untreated surface |
Riferimenti
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