반복적 확산 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 외상 후 간질 유도
Summary
이 체계적인 프로토콜은 반복적인 가벼운 외상성 뇌 손상 후에 외상 후 간질의 새로운 동물 모델을 설명합니다. 첫 번째 부분은 수정된 체중 감소 모델을 사용하여 외상성 뇌 손상 유도 단계를 자세히 설명합니다. 두 번째 부분은 단일 및 다중 채널 뇌전도 데이터 수집 시스템에 대한 수술 접근 방식에 대한 지침을 제공합니다.
Abstract
외상성 뇌 손상 (TBI)은 후천성 간질의 주요 원인입니다. TBI는 초점 또는 확산 뇌 손상을 초래할 수 있습니다. 초점 상해는 뇌 조직에 직접적인 병변을 만드는 두개골을 통해 때때로 관통하는 직접적인 기계적 힘의 결과입니다. 이들은 타박상, 열상 및 출혈을 가진 지역으로 두뇌 화상 진찰 도중 보입니다. 국소 병변은 신경 세포 죽음과 신경교 흉터 형성을 유도하고 TBI를 발생 모든 사람들의 20 %-25 %에 존재한다. 그러나, TBI 케이스의 대다수에서, 상해는 비 초점, 확산 손상의 결과로 가속 감속 력 및 후속 조직 전단에 기인합니다. TBI 환자의 소집단은 몇 달 또는 년의 대기 기간 후에 외상 후 간질 (PTE)를 개발하는 것을 계속합니다. 현재, 어떤 환자가 PTE를 개발할지 예측하는 것은 불가능하며, PTE 환자의 발작은 통제하기가 어렵기 때문에 추가 연구가 필요합니다. 최근까지, 필드는 피질에 있는 거대한 조직 손실을 가진 큰 초점 병변및 때때로 피질 구조물을 가진 두 개의 자발적인 외상 후 포착을 가진 두 개의 동물/설치류 모형으로 제한되었습니다. 이러한 접근법과는 대조적으로, 변형된 체중 투하 모델을 사용하여 유도된 확산 TBI가 국소 병변 또는 조직 손실이 없는 경우에도 자발적인 경련성 및 비경련성 발작의 개발을 개시하기에 충분하다고 판단되었다. 후천성 외상 후 간질을 가진 인간 환자와 유사하게, 이 모형은 포착 개시의 앞에 상해 후에 대기 기간으로 제출합니다. 이 프로토콜에서, 지역 사회는 몇 달의 과정을 통해 지속적인 장기 비디오 뇌전도 동물 모니터링 에 이어 확산 비 lesional TBI를 유도하는 방법을 자세히 외상 후 간질의 새로운 모델을 제공 할 것입니다. 이 프로토콜은 동물 취급, 체중 감소 절차, 두 개의 수집 시스템에 대한 전극 배치 및 수술, 수술 후 모니터링 및 데이터 수집의 각 단계에서 발생하는 빈번한 과제를 자세히 설명합니다.
Introduction
매년 TBI는 전 세계적으로 약 6천만 명에게 영향을 미칩니다. 영향 받은 개별은 초기 상해 후에 년을 명시할 수 있는 간질 개발의 고위험에 입니다. 가혹한 TBI는 간질의 고위험과 연관되더라도, 온화한 TBI조차 간질 발전의 개별의 기회를 증가합니다1,2,3,4. 모든 TI는 초점, 확산 또는 둘 다의 조합으로 분류될 수 있습니다. 확산 뇌 손상, 많은 경우 모든 TI에 존재, 때문에 가속 감속 및 회전 힘으로 서로 에 대해 전단 다른 밀도의 뇌 조직의 결과입니다. 정의에 따르면, 확산 상해는 컴퓨터 단층 촬영 스캔에 뇌 병변이 보이지 않는 경증 / 뇌진탕 비 관통 뇌 손상에서 만발생5.
외상 후 간질 (PTE)을 개발하거나 위험에 처한 환자의 관리에는 현재 두 가지 중요한 문제가 있습니다. 첫 번째는 PTE가 나타나면 발작이 사용 가능한 항 간질 약물 (AED)에 내성이 있다는 것입니다6. 둘째, AEDs는 간질 발생을 예방하는 데 동등하게 효과가 없으며 효과적인 대체 치료 접근법이 없습니다. 이 적자를 해결하고 치료를위한 더 나은 치료 목표와 후보를 찾기 위해, PTE6의뿌리에서 새로운 세포 및 분자 메커니즘을 탐구할 필요가있을 것이다.
외상 후 간질의 두드러진 특징 중 하나는 초기 외상 성 사건과 자발적, 도발적이지 않은 재발성 발작의 발병 사이의 잠복 기간입니다. 이 시간 창에서 발생하는 이벤트는 연구원을위한 자연적인 초점입니다, 이 시간 창은 모두 PTE의 치료와 예방을 허용 할 수 있기 때문에. 동물 모델은 몇 가지 뚜렷한 이점을 제공하기 때문에 이 연구에 가장 일반적으로 사용되며, 그 중 가장 적은 것은 인간 환자의 지속적인 모니터링이 잠재적으로 긴 시간 동안 비실용적이고 비용이 많이 들 것이라는 것입니다. 추가적으로, 간질 발생의 루트에 있는 세포와 분자 기계장치는 동물 모형에서만 탐구될 수 있습니다.
자발적인 외상 후 발작 및 간질을 가진 동물 모델은 화학 흡충제 또는 전기 자극에 의해 급성, 만성, 또는 점화에 의해 보다 적게 생리학적으로 관련성이 있는 수단에 의해 TBI 후에 포착이 유도되는 모형에 선호됩니다. 자발적인 외상 후 발작 모델은 TBI가 간질 발생으로 이어지는 건강한 뇌 네트워크를 어떻게 수정하는지 테스트합니다. TBI에 노출이 발작 임계값을 감소시키고 포착에 감수성에 영향을 미치는 방법을 TBI 후에 추가 자극을 사용하는 연구 결과. 화학적으로 또는 전기 자극을 유도한 발작을 가진 동물 모형의 이점은 AEDs에 내화성의 특정 기계장치 및 기존 및 신규 한 AEDs의 효험을 시험하기 에서 입니다. 그러나, 인간에게 이러한 데이터의 관련성 및 번역의 정도는 다음과 같은 이유로 모호한7일 수 있습니다: 1) 발작 메커니즘은 TBI에 의해 유도된 메커니즘과 다를 수 있습니다. 2) 이러한 모델의 모든 자발적인 발작으로 이어질7; 3) 경련제 자체에 의해 생성된 병변은, 캐뉼라가 그 전달에 요구되거나, 또는 깊이 구조(예를 들어, 해마 또는 편도체)에서 전극 배치를 자극함으로써 이미 발작 감수성 및 심지어 해마 간질 전위 잠재력을 증가시킬 수 있다7. 더욱이, 일부 경련제(즉, 카이닉산)는 TBI 확산 후 전형적이지 않은 직접적인 해마 병변 및 경화증을 생성한다.
최근까지, 외상 후 간질의 단지 2개의 동물 모형존재: 통제된 피질 충격 (CCI, 초점) 또는 유체 타악기 상해 (FPI, 초점 및 확산)8. 두 모델 모두 설치류의 조직 손실, 출혈 및 글리오시스와 함께 큰 국소 병변을 초래합니다8. 이 모형은 큰 초점 병변에 의해 유도된 외상 후 간질을 모방합니다. 최근 연구는 반복 (3x) 확산 TBI가 초점 병변의 부재에도 마우스에서 자발적인 발작과 간질의 개발을 위해 충분하다는 것을 입증9,확인 된 자발적인 재발 성 발작과 세 번째 설치류 PTE 모델을 추가. 이 새로운 모형은 온화한, 뇌진탕 TBI를 가진 인간 인구를 더 잘 나타내는 확산 TBI에 의해 유도된 세포와 분자 변경을 모방합니다. 이 모델에서는, 발작 개시 및 늦은, 자발적, 재발성 발작의 출현 의 출현 의 3 주 이상 잠복 기간은 외상 후 간질 발생의 근본 원인을 조사하고, 발작 개시 후 예방 접근법 및 새로운 치료 후보의 효능을 테스트하고, 외상 후 간질 의 바이오 마커의 개발 가능성이 있다.
외상 후 간질 연구를 위한 동물 모델의 선택은 과학적 질문, 조사된 뇌 손상의 유형 및 기본 세포 및 분자 메커니즘을 결정하는 데 사용되는 도구에 따라 달라집니다. 궁극적으로, 외상 후 간질의 모든 모델은 TBI 동물의 하위 집합에서 자발적인 발작의 출현과 TBI 동물의 하위 집합에서 초기 대기 기간 모두를 입증해야합니다, TBI를 발생시키는 모든 환자는 간질을 개발하기 위해 계속하지 않기 때문에. 이를 위해 동시 비디오 수집을 통해 뇌파(EEG)가 이 프로토콜에 사용됩니다. 정확한 데이터 해석을 위해 데이터 수집 하드웨어 및 접근 방식의 기술적 측면을 이해하는 것은 매우 중요합니다. 중요한 하드웨어 측면에는 기록 시스템의 유형, 전극 유형(나사 또는 와이어 리드) 및 이들이 만든 재료, 동기화된 비디오 수집(EEG 시스템 또는 제3자의 일부) 및 컴퓨터 시스템의 특성이 포함됩니다. 연구 목표, 관심 있는 EEG 이벤트, 추가 분석 방법 및 데이터 스토리지의 지속 가능성에 따라 모든 유형의 시스템에서 적절한 수집 매개 변수를 설정하는 것이 필수적입니다. 마지막으로, 각각의 장점과 단점을 가지고 있으며 데이터 해석에 영향을 미치기 때문에 전극 구성 (montage)의 방법을 고려해야합니다.
이 프로토콜은 마우스에서 자발적, 도발적이지 않은, 재발성 발작을 초래하는 확산 상해를 유도하기 위해 변형된 Marmarou 중량 투하 모델10,11을 사용하는 방법을 자세히 설명하고, 단극성, 양극성 또는 혼합 몽타주를 사용하여 단일 및 다중 채널 연속 및 동기화된 비디오 EEG를 획득하는 외과적 접근법을 설명한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
초점 과 확산 상해의 초점 또는 조합을 유도하는 CCI 및 FPI 모형과는 대조적으로, 이 프로토콜에 기술된 반복적인 확산 TBI의 모형은 초점 두뇌 상해의 부재에 확산 상해의 유도를 허용하고 두피 또는 두개골 개구부 및 관련염증을 요구하지 않습니다. 이 모델에서 두개골 절제술의 부재의 추가 장점은 만성 연속 EEG 기록을 위한 전극을 이식할 수 있다는 것입니다, 또한 동물의 만성 생체 내 2 광자 화…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 R01 NS105807/NS/NINDS NIH HHS/미국 및 CURE에 의해 지원되었다 미국 육군 의학 연구 및 마테리엘 사령부에서 받은 보조금 CURE에 따라, 국방부 (국방부), 수상 No. W81XWH-15-2-0069. 이반 주이드후크는 원고를 교정해 주신 것에 대해 높이 평가받고 있습니다.
Materials
| 0.10" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8209 | 0.10 inch long stainless steel |
| 0.10" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8403 | 0.10 inch long with pre-soldered wire lead |
| 0.12" screw | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8212 | 0.12 inch long stainless steel |
| 1EEG headmount | Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA | MS333/8-A/SPC | 3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal |
| 2EEG/1EMG headmount | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8201 | 2EEG/1EMG channels |
| 3% hydrogen peroxide | Pharmacy | ||
| 3EEG headmount | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | 8235-SM-C | custom 6-Pin Connector for 3EEG channels |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA | 060969 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA | 060969 | |
| C57BL/6 mice | Harlan/Envigo Laboratories Inc | male, 12-16 weeks old | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | male, 12-16 weeks old | |
| Carprofen | Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA | 026357 | NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day |
| Chlorhexidine antiseptic | Pharmacy | ||
| Dental cement and solvent kit | Stoelting Co., USA | 51459 | |
| Drill | Foredom | HP4-917 | |
| Drill bit | Meisinger USA, LLC, USA | HM1-005-HP | 0.5 mm, Round, 1/4, Steel |
| Dry sterilizer | Cellpoint Scientific, USA | Germinator 500 | |
| EEG System 1 | Biopac Systems, CA, USA | ||
| EEG System 2 | Pinnacle Technology Inc., KS, USA | ||
| Ethanol ≥70% | VWR, USA | 71001-652 | KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof) |
| Eye ointment | Pro Labs Ltd, USA | Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies | |
| Fluriso liquid for inhalation anesthesia | MWI Veterinary Supply Co., USA | 502017 | |
| Hair removal product | Church & Dwight Co., Inc., USA | Nair cream | |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply Co., USA | 502017 | |
| Povidone-iodine surgical solution | Purdue Products, USA | 004677 | Betadine |
| Rimadyl/Carprofen | Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA | 026357 | |
| Solder | Harware store | ||
| Soldering iron | Weller, USA | WP35 | ST7 tip, 0.8mm |
| Stainless steel disc | Custom made | ||
| Sterile cotton swabs | |||
| Sterile gauze pads | Fisher Scientific, USA | 22362178 | |
| Sterile poly-lined absorbent towels pads | Cardinal Health, USA | 3520 | |
| Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, USA | 1469SB |
Riferimenti
- Christensen, J., et al. Long-term risk of epilepsy after traumatic brain injury in children and young adults: a population-based cohort study. Lancet. 373 (9669), 1105-1110 (2009).
- Lowenstein, D. H. Epilepsy after head injury: an overview. Epilepsia. 50, 4-9 (2009).
- Ferguson, P. L., et al. A population-based study of risk of epilepsy after hospitalization for traumatic brain injury. Epilepsia. 51 (5), 891-898 (2010).
- Abou-Abbass, H., et al. Epidemiology and clinical characteristics of traumatic brain injury in Lebanon: A systematic review. Medicine (Baltimore). 95 (47), 5342 (2016).
- Management of Concussion/mTBI Working Group. VA/DoD Clinical Practice Guideline for Management of Concussion/Mild Traumatic Brain Injury. The Journal of Rehabilitation Research and Development. 46 (6), 1-68 (2009).
- Piccenna, L., Shears, G., O’Brien, T. J. Management of post-traumatic epilepsy: An evidence review over the last 5 years and future directions. Epilepsia Open. 2 (2), 123-144 (2017).
- Loscher, W., Brandt, C. Prevention or modification of epileptogenesis after brain insults: experimental approaches and translational research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
- Ostergard, T., Sweet, J., Kusyk, D., Herring, E., Miller, J. Animal models of post-traumatic epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 272, 50-55 (2016).
- Shandra, O., et al. Repetitive Diffuse Mild Traumatic Brain Injury Causes an Atypical Astrocyte Response and Spontaneous Recurrent Seizures. Journal of Neuroscience. 39 (10), 1944-1963 (2019).
- Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
- Marmarou, A., et al. A new model of diffuse brain injury in rats. Part I: Pathophysiology and biomechanics. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 291-300 (1994).
- Paxinos, G., Keith, B. J., Franklin, M. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2007).
- Shandra, O., Robel, S. Imaging and Manipulating Astrocyte Function In Vivo in the Context of CNS Injury. Methods in Molecular Biology. 1938, 233-246 (2019).
- Pitkanen, A., Immonen, R. Epilepsy related to traumatic brain injury. Neurotherapeutics. 11 (2), 286-296 (2014).
- Kharatishvili, I., Nissinen, J. P., McIntosh, T. K., Pitkanen, A. A model of posttraumatic epilepsy induced by lateral fluid-percussion brain injury in rats. Neuroscienze. 140 (2), 685-697 (2006).
- Pitkanen, A., Bolkvadze, T., Immonen, R. Anti-epileptogenesis in rodent post-traumatic epilepsy models. Neuroscience Letters. 497 (3), 163-171 (2011).
- Gades, N. M., Danneman, P. J., Wixson, S. K., Tolley, E. A. The magnitude and duration of the analgesic effect of morphine, butorphanol, and buprenorphine in rats and mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 39 (2), 8-13 (2000).
