שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים

הדג הגדול הינו אורגניזם מודל לביולוגיה התפתחותית, והמיקרוסקופיה היא השיטה העיקרית להמחיש את ההתפתחות העובלנית. יתרונות השימוש בעוברי דגים למחקרים התפתחותיים כוללים גודל קטן, בהירות אופטית, פיתוח מהיר ופוריות גבוהה של הדג המבוגר. הדור של הקווים הטרנסגניים המבטא זריחה ברקמות או תאים מסוימים אפשרו הדמיה ישירה של פיתוח רקמות בדרכים לא אפשרי עם בעלי חיים גדולים יותר בעלי חוליות. בשילוב עם מיקרוסקופ לשגות בזמן, פרטים ודינמיקה של פיתוח רקמות ניתן ללמוד בקלות.

קושי בהתפתחות הדמיה של דגי ההדמיה הוא שהעוברים גדלים באופן משמעותי באורך; העובר מרחיב את אורכו ארבע פעמים בתוך 3 הימים הראשונים של החיים¹. גם, הגוף של העובר המוקדם הוא רך, ובקלות הופך להיות מעוות אם הצמיחה היא מוגבלת. ובכל זאת, כדי לבצע מיקרוסקופ ממוקד, העובר חייב להיות ללא תנועה. כדי לשמור על העוברים בעמדה קבועה עבור הדמיה זמן מיקוד התמונה, הם מורדם באופן קבוע ורכוב ב 0.3-1% נמוך להמיס. לדבר זה יש יתרון של התרת צמיחה מסוימת במהלך ההדמיה לתקופה מסויימת, תוך הגבלת תנועות העובר. חלקים של העובר יכול להיות ביעילות להיות בתמונה כך. עם זאת, בעת שימוש בשיטה זו עבור הדמיה של העובר כולו עבור פרקי זמן מורחבים, עיוותים הם נצפו בשל הצמיחה המוגבלת הנגרמת על ידי הצמח. לכן, נדרשות שיטות הרכבה אחרות. קאופמן ועמיתיו תיארו הרכבה חלופית של עוברי דג דג זברה עבור מיקרוסקופ גיליון אור, כגון מיקרוסקופ התאורה סלקטיבי המטוס (spim), על ידי הרכבה העוברים ב-fluorinated אתילן פרופילן (fep) צינורות המכילים ריכוזים נמוכים של agarose או מתילתאית². טכניקה זו מייצרת ויזואליזציה מעולה של embryogenesis לאורך זמן. Schmid ואח ‘ לתאר הרכבה של עד שישה עוברים ב agarose בצינורות פבואר עבור מיקרוסקופ גיליון אור³ מתן ויזואליזציה של מספר עוברים במפגש אחד הדמיה. בתבניות נעשה שימוש כדי ליצור מערכי העובר להרכבה יעילה של מספר גדול יותר של עוברים⁴. מסקינקיות ואח ‘ בנויים בתבניות פלסטיק מודפס 3d שניתן להשתמש בהם כדי להפוך סיליקון מטיל כי העוברים בשלבים שונים ניתן להציב, המאפשר להרכבה בעמדה קבועה עבור הדמיה, כולל הדמיה קונפוקלית וקד⁵. הדפסה תלת-ממדית השתמשה גם כדי ליצור תבניות עבור מיקום עקבי של עוברי צבפיש 96-ובכן פורמט⁶. תבניות מסוימות מותאמות אישית עבור שלבים מסוימים ולא ניתן להתיר צמיחה בלתי מוגבלת לפרקי זמן ארוכים, בעוד שתבניות אחרות גמישות יותר. לאחרונה, Weijts ואח ‘ פרסמה את העיצוב והייצור של מאכל ארבע היטב עבור הדמיה חיה של עוברי דגים^{שבעה 7}. בתבשיל זה, הזנב והגזע של עוברי דגים מורדם ממוקמים באופן ידני תחת גג סיליקון ברור מחובר ממש מעל זכוכית כיסוי כדי ליצור כיס. העובר הוא תוקן לאחר מכן במיקום זה על ידי תוספת של 0.4% agarose. הרכבה זו מאפשרת הדמיה של החלק האחורי של כ 2 מ”מ (העורק והזנב) של העובר, וכמו עד 12 עוברים ניתן לרכוב לכל טוב, השיטה מאפשרת הדמיה של דגימות מרובות. באופן דומה, הירסינגר ו סטבנטון הציגו לאחרונה שיטה שבה ראש הדג מותקן בתוך agarose, בעוד הזנב יכול לצמוח בחופשיות, ושיטה זו גם מקלה ביעילות הדמיה של הגזע והזנב של העובר⁸.

מאמר זה מתאר שיטת הרכבה שכבתית עבור עוברי דגים המגבילים את תנועות העוברים תוך התרת צמיחה בלתי מוגבלת. היתרונות של שיטה זו הרכבה הם כי היא בעלות נמוכה, שיטה מהירה וקל לעלות על העוברים של שלבים שונים עבור הדמיה באמצעות כל מיקרוסקופ הפוך. ההרכבה מאפשרת הדמיה ארוכת טווח של הגוף כולו (ראש, גזע וזנב) במהלך התפתחות העובר. כדי להציג את השימושיות של שיטה זו, כלי הדם של העובר כולו, התפתחות עצבית ושרירים הייתה מתמונה בדגים טרנסגניים. שני עוברים בכל הפעלה, בשני אורכי גל תלת-ממד הוצגו על ידי מיקרוסקופ הזמן לשגות עבור 55 שעות רצופות כדי להפוך סרטים של פיתוח רקמות.