Isolement fiable des micronavires du système nerveux central dans cinq groupes de vertébrés
Summary
Le but de ce protocole est d’isoler les micronavires de plusieurs régions du système nerveux central des vertébrés lissencephalic et gyrencephalic.
Abstract
L’isolement des microvaisseaux du système nerveux central (SNC) est généralement effectué en combinant le tissu cortical de plusieurs animaux, le plus souvent des rongeurs. Cette approche limite l’interrogation des propriétés de la barrière hémato-encéphalique (BBB) au cortex et ne permet pas de comparaison individuelle. Ce projet se concentre sur le développement d’une méthode d’isolement qui permet la comparaison de l’unité neurovasculaire (NVU) à partir de plusieurs régions du SNC : cortex, cervelet, lobe optique, hypothalamus, pituitaire, tronc cérébral et moelle épinière. En outre, ce protocole, initialement développé pour les échantillons de murine, a été adapté avec succès pour une utilisation sur les tissus du SNC à partir de petites et grandes espèces de vertébrés à partir de laquelle nous sommes également en mesure d’isoler les micronavires de la matière blanche de l’hémisphère cérébral. Cette méthode, lorsqu’elle est jumelée à l’immunolabeling, permet la quantitation de l’expression des protéines et la comparaison statistique entre les individus, le type de tissu ou le traitement. Nous avons prouvé cette applicabilité en évaluant des changements dans l’expression de protéine pendant l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE), un modèle murine d’une maladie neuroinflammatoire, sclérose en plaques. En outre, les micronavires isolés par cette méthode pourraient être utilisés pour des applications en aval comme qPCR, RNA-seq, et Western blot, entre autres. Même s’il ne s’agit pas de la première tentative d’isoler les micronavires du SNC sans l’utilisation d’ultracentrifugation ou de dissociation enzymatique, il est unique dans son aptitude à la comparaison des individus isolés et de plusieurs régions du SNC. Par conséquent, il permet d’enquêter sur une gamme de différences qui pourraient autrement rester obscures : parties du SNC (cortex, cervelet, lobe optique, tronc cérébral, hypothalamus, pituitaire et moelle épinière), type tissu du SNC (matière grise ou blanche), individus, groupes de traitement expérimental et des espèces.
Introduction
Notre cerveau est l’organe le plus important de notre corps. Pour cette raison, garder l’homéostasie du cerveau en dépit de facteurs externes qui peuvent déclencher une déviation de la normalité est une priorité. Selon certains chercheurs, il y a environ 400 à 500 millions d’années1, les animaux vertébrés ont développé ce que nous connaissons aujourd’hui comme la barrière hémato-encéphalique (BBB)2,3. Cette « clôture » protectrice exerce la plus grande influence sur l’homéostasie et les fonctions du système nerveux central (SNC) en régulant étroitement le transport des ions, des molécules et des cellules entre le sang et le parenchyme du SNC. Lorsque le BBB est perturbé, le cerveau devient sensible à l’exposition toxique, l’infection et l’inflammation. Par conséquent, le dysfonctionnement de BBB est associé à beaucoup, sinon tous, désordres neurologiques et neurodevelopmental4,5,6.
La fonction sophistiquée du BBB est attribuée à la microvasculature unique du SNC conforme par l’unité neurovasculaire (NVU)2,3. Les cellules endothéliales hautement spécialisées, les péricytes et les pieds d’extrémité astrocytiques sont les composants cellulaires du NVU2,3. La matrice extracellulaire générée par ces cellules est également essentielle à la physiologie NVU et BBB2,3. Bien que les composants cellulaires et moléculaires essentiels de la NVU soient conservés chez les vertébrés, l’hétérogénéité est signalée chez les ordres et les espèces7,8. Cependant, les limitations techniques entravent notre capacité à considérer pleinement ces différences dans la neurobiologie, la recherche biomédicale ou translationnelle.
Pour cette raison, nous avons élargi une méthode d’isolement micronavire spécifique à la région du SNC pour la rendre applicable à de nombreuses espèces des cinq groupes de vertébrés : poissons, amphibiens, reptiles, oiseaux et mammifères. Le protocole est décrit pour une utilisation sur les vertébrés de petite-lissencéphale et de grande gyrencéphalie, y compris les espèces avec la pertinence translationnelle9. En outre, nous incluons d’autres régions du SNC non étudiées auparavant dans ce contexte, mais pertinentes à la neurophysiologie et avec des implications cliniques énormes : l’hypothalamus, l’hypotuitaire et la matière blanche. Enfin, nous avons testé la capacité de cette méthode d’isolement comme un outil fiable pour identifier les changements dans l’expression des protéines le long de la NVU et / ou BBB9,10,11. Comme preuve de concept, nous avons montré comment déterminer les changements dans l’expression VCAM-1 et JAM-B pendant EAE utilisant la méthode d’isolement suivie de l’immunofluorescence.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le BBB comprend les propriétés uniques des cellules endothéliales microvasculature du cerveau couplées par une architecture sophistiquée de serré, adherens-, “peg-socket”- jonctions, et plaques d’adhérence critique pour l’homéostasie du SNC2,3,19. Les propriétés des cellules endothéliales sont induites et maintenues par les péritéytes et les processus d’astroglia environnants2,<sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le Dr Cruz-Orengo a reçu le soutien de l’Université de Californie, Davis, School of Veterinary Medicine Start Up Funds.
Materials
| 10X PBS | ThermoFisher | BP39920 | Used for blocking and antibody diluent. |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | Used as fixative (4% PFA) |
| 70,000 MW Dextran | Millipore Sigma | 9004-54-0 | Used for MV-2 solution |
| Adson Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11006-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Adson Forceps, student quality | FST | 91106-12 | Same as above but cheaper |
| Bovine serum albumin (BSA) | Millipore Sigma | A7906-100G | Used for MV-3 solution, blocking and antibody diluent |
| Corning 100 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431752-50EA | |
| Corning 70 μm Cell strainer | Millipore Sigma | CLS431751-50EA | |
| Corning Deskwork low-binding tips | Millipore Sigma | CLS4151 | Same as below but cheaper. |
| Cultrex Poly-D-Lysine | R&D | 3439-100-01 | Used for slide coating |
| Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21432 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21202 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 488 | Thermo | A21206 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rabbit IgG-ALEXA 647 | Thermo | A31573 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Donkey anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10029 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Double-Pronged Tissue Pick | FST | 18067-11 | Used for removal of meninges and choroid plexus |
| Dumont #3c Forceps | FST | 11231-20 | Used for more delicate and/or small CNS tissue handling (like pituitary) |
| Dumont #7 Forceps | FST | 11274-20 | Used for CNS tisssue dissection and handling |
| Dumont #7 Forceps, student | FST | 91197-00 | Same as above but cheaper |
| ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips | Eppendorf | 22493008 | Better quality than the tips above (more expensive). |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | FST | 11151-10 | Used for bone removal |
| Fine Scissors, sharp | FST | 14060-09 | Used for removal of pig and macaque dural sac |
| Glass Pestle 1.5 mL Microcentrifuge Tube Tissue Grinder Homogenizer, Pack of 10 | Chang Bioscience Inc. (eBay) | GP1.5_10 | Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Goat anti-CXCL12, biotinylated | PeproTech | 500-P87BGBT | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution: 1:20. |
| Goat anti-JAM-B | R&D | AF1074 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 488 | Thermo | A11001 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Mouse IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21424 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-PDGFRβ | R&D | AF1042 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Goat anti-Rabbit IgG-ALEXA 555 | Thermo | A21249 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rabbit IgG-DyLight 488 | Thermo | 35552 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Goat anti-Rat IgG-DyLight 650 | Thermo | SA5-10021 | Used as secondary antibody. Recommended dilution of 1:200. |
| Graefe Forceps, curved tip, 1X2 teeth | FST | 11054-10 | Use for nylon filter net holding and shaking |
| HBSS, 1X buffer with calcium and magnesium | Corning | 21-022-CM | Used for MV-1 solution |
| HEPES, 1M liquid buffer | Corning | 25-060-CI | Used for MV-1 solution |
| Isolectin GS-IB4-Biotin-XX | ThermoFisher Scientific (Thermo) | I21414 | Glycoprotein isolated from legume Griffonia simplicifolia that binds D-galactosyl residues of endothelial cell glycocalysx. Used for avian and porcine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| LaGrange Scissors, serrated | FST | 14173-12 | Used for skull dissection and laminectomy (except pig and macaque) |
| Millicell EZ slide 8-well unit | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Mouse anti-CLDN5 | Thermo | 35-2500 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-GGT1 | Abcam | ab55138 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-Human CD31 | R&D | BBA7 | Used as primary antibody on primate CNS microvessels. Recommended concentration: 16.5 μg/mL. |
| Mouse anti-NFM | Thermo | RMO-270 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Mouse anti-αSMA | Thermo | MA5-11547 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Nylon Filter Net, roll | Millipore Sigma | NY6000010 | Laser-cut to 13 mm diameter filter net discs. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 25 mm | Millipore Sigma | NY2002500 | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Nylon Filter Nets, 47 mm | Millipore Sigma | NY2004700 | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | ThermoFisher | P36935 | Used to coverslip slides. |
| Rabbit anti-AQP4 | Millipore Sigma | A5971 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-LSR | Millipore Sigma | SAB2107967 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-NG2 | Millipore Sigma | AB5320 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rabbit anti-OSP | Abcam | ab53041 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 1 μg/mL. |
| Rabbit anti-VE-Cadherin | Abcam | ab33168 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rabbit anti-ZO-1 | Thermo | 61-7300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-CD31 | Becton Dickinson | BD 550274 | Used as primary antibody for murine CNS microvessels. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Rat anti-GFAP | Thermo | 13-0300 | Used as primary antibody on CNS microvessels from all specimens. Recommended dilution of 1:200. |
| Rat anti-VCAM-1 | Becton Dickinson | BD 553329 | Used as primary antibody to assess neuroinflammation. Recommended concentration: 5 μg/mL. |
| Sterile Ringer's Solution, Frog | Aldon Corporation | IS5066 | Used for amfibian anesthesia |
| Streptavidin-ALEXA 555 | Thermo | S32355 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Streptavidin-ALEXA 647 | Thermo | S32357 | Used as secondary antibody to label biotinylated primary antibodies. Recommended dilution of 1:500. |
| Surgical Scissors, sharp | FST | 14002-12 | Used for removal of muscle and skin |
| Surgical Scissors, sharp-blunt | FST | 14001-16 | Used for decapitation (except pig and macaque) |
| Swinnex Filter Holder, 13 mm | Millipore Sigma | SX0001300 | Modified by laser-cut. Used for small vetebrate hypothalus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | Millipore Sigma | SX0002500 | Modified by laser-cut. Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Swinnex Filter Holder, 47 mm | Millipore Sigma | SX0004700 | Modified by laser-cut. Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
| Triton X-100 | ThermoFisher | 50-165-7277 | Used for blocking and antibody diluent. |
| Wheaton 120 Vac Overhead Stirrer | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 62400-904 (DWK #903475) | Used for macaque and pig CNS tissues with 55 mL tissue grinder, except hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 10 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-384 (DWK #357979) | Used on most small vertebrates CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. Used for macaque and pig hypothalamus and pituitary. |
| Wheaton Potter-Elvehjem tissue grinder with PTFE pestle, 55 mL | VWR (Supplier DWK Life Sciences) | 14231-372 (DWK #357994) | Used for macaque and pig CNS tissues, except hypothalamus and pituitary. |
Riferimenti
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