新規ビオチニル化酵素の選択のための細菌ペプチド表示

タンパク質のバイオチリン化は、その親和性の単離および検出のための強力なタグを作成します。酵素タンパク質バイオチニル化は、ビオチンタンパク質リチウムによって触媒された非常に特異的な翻訳後修飾である。大腸菌ビオチンタンパク質リゲスBirAは、非常に特異的であり、共有的に特定のリジン残^剤1で天然に存在するタンパク質の制限された数のみを共有生物化する。BirA触媒バイオチニル化の利点は、現在、効果的にビオチン化された^小さな合成15-アミノ酸ビオチンアクセプテイタペプチド(AP)と標的タンパク質を融合することによって利用され、非常に特異的であり、Via^3,4,5の共発現または添加による生体内およびインビトロバイオチニル化の効率的な。インビボおよびインビトロBirA触媒ビオチンタンパク質ライゲーションは魅力的な標識戦略ですが、その用途はAP融合タンパク質を含むサンプルに限定されています。この方法の目的は、天然の未修飾タンパク質を選択的に生体化し、酵素生物化戦略を使用できるアプリケーションの数を拡大するビオチンタンパク質リチウムの新しい変異体の開発です。

タンパク質機能は、所望の機能を有する遺伝子変異、選択、増幅の反復ラウンドを通じて進化させることができる。強く、有効な選択戦略は、指向性進化のために重要であり、ビオチンタンパク質リガーゼ活性は、ビオチンとストレプトアビジンとそのホモ^ログ6との間の強い結合のために容易に選択される。ファージディスプレイ技術は、バイオチニル化ペプチ^ド7、8を表示するファージの選択を可能^にします。しかし、単離されたファージの増幅は細菌宿主の感染を必要とするので、ストレプトアビジンを用いたファージ選択は、非変性下でのビオチンとストレプトアビジンの高親和性結合が事実上不可逆的であるという点でボトルネックを生み出す。条件。ビオチン化ファージの可逆結合を確実にするために、親和性の低いモノメリックアビジンが使用され、その結果、適度〜10倍の^濃縮7が得られた。我々は最近、アフィニティマトリックスからの溶出の必要性を排除し、それによって以前のBirA^{選択システム9}からボトルネックを取り除く新しいBirA変異体の単離のための細菌表示方法を開発した。実際、当社の細菌表示システムは、1回の選択^{ステップ9}で活性クローンの>1,000,000倍の濃縮を可能にし、新規のBirA変異体の指向進化のための効果的な選択システムを提供します。

当社の細菌表示システムは、C末端6xHisタグを持つBirAと、標的ペプチドの表面表示を可能にする足場タンパク質の2つの成分で構成されています。ペプチドの有効表示はN-ターミニ10、11の両方で観察することができるので、我々は、円形に透過した外膜タンパク質X(eCPX)を増強足場タンパク質を用いた。標的ペプチド配列をeCPXのC-終位に融合させることで、活性BirA変異体を発現する細菌の生体化が保証される。細菌は、ビオチン化ペプチドが表面に表示されるようになったように効果的なストレプトアビジン選択を可能にする(図1a)。

この方法の目的は、天然タンパク質に存在するペプチド配列をビオチン化するBirAの新規変異体を選択することです。このシステムは、プラスミドpBAD-BirA-eCPX-AP上に存在する遺伝子によってコードされ、これは、アビノセ誘導性プロモーターを含むBirA(araBAD)、およびeCPX⁹を制御するT7プロモーター(図1b)を含む。本プロトコルは、1)標的タンパク質由来のペプチドをeCPXのC末端に組み込む場合の詳細な手順、2)エラーが起こりやすいPCRによるBirAの変異ライブラリーの作成、3)ストレプトアビジン結合細菌の選択について説明する。磁気活性化細胞選別(MACS)、4)細菌濃縮の定量化、および5)単離クローンの初期特性特性。