Visualizzazione del peptide batterico per la selezione di nuovi enzimi biotinylami
Summary
Qui presentiamo un metodo per selezionare per nuove varianti della ligase biotina-proteina E. BirA che biotinyili uno specifico peptide bersaglio. Il protocollo descrive la costruzione di un plasmide per la visualizzazione batterica del peptide bersaglio, la generazione di una libreria BirA, la selezione e la caratterizzazione delle varianti BirA.
Abstract
La biotina è un’interessante modifica post-traduzionale delle proteine che fornisce un potente tag per l’isolamento e il rilevamento delle proteine. La biotinyalazione enzimatica da parte della ligase biotina-proteina E. tuttavia, l’attuale utilizzo della biotinylazione mediata BirA richiede la presenza di un peptide accettatore sintetico (AP) nella proteina bersaglio. Pertanto, la sua applicazione è limitata alle proteine che sono state progettate per contenere l’AP. Lo scopo del protocollo attuale è quello di utilizzare la visualizzazione batterica di un peptide derivato da una proteina bersaglio non modificata per selezionare per le varianti BirA che biotinyla il peptide. Il sistema si basa su un singolo plasmide che consente la co-espressione delle varianti BirA insieme a un’impalcatura per la visualizzazione del peptide sulla superficie batterica. Il protocollo descrive una procedura dettagliata per l’incorporazione del peptide bersaglio nello scaffold di visualizzazione, la creazione della libreria BirA, la selezione delle varianti BirA attive e la caratterizzazione iniziale delle varianti Isolate BirA. Il metodo fornisce un sistema di selezione altamente efficace per l’isolamento di nuove varianti BirA che possono essere utilizzate per l’ulteriore evoluzione diretta dei ligas proteici biotina che biotinyano una proteina nativa in soluzioni complesse.
Introduction
La biotinyalazione di una proteina crea un tag potente per il suo isolamento e rilevamento dell’affinità. La biotinylazione delle proteine ezimatiche è una modificazione post-traduzionale altamente specifica catalizzata dai ligas di biotina-proteina. La ligase biotina-proteina E. BirA è estremamente specifica e covalentmente biotinyla solo un numero limitato di proteine naturali a specifici residui di lisina1. I vantaggi della biotinylazione catalizzata BirA sono attualmente sfruttati fondendo la proteina bersaglio con un piccolo peptide biotina aminoacido sintetico (AP) che è efficacemente biotinylated2 e consente l’altamente specifico e biotinylazione in vivo e in vitro efficiente per co-espressione o aggiunta di BirA3,4,5. Anche se la legatura biotina-proteina in vivo e in vitro BirA catalizzata è un’interessante strategia di etichettatura, la sua applicazione è limitata a campioni che contengono proteine Fuse AP. Lo scopo di questo metodo è lo sviluppo di nuovi mutanti di legamenti biotino-proteine che biotinylano selettivamente le proteine native non modificate e, quindi, espandono il numero di applicazioni in cui può essere utilizzata la strategia di biotinylazione enzimatica.
La funzione proteica può essere evoluta attraverso cicli iterativi della mutazione genica, della selezione e dell’amplificazione delle varianti genetiche con la funzione desiderata. Una strategia di selezione forte ed efficiente è fondamentale per l’evoluzione diretta e l’attività della ligase biotina-proteina è facilmente selezionata a causa del forte legame tra biotina e streptavidin ai suoi omologhi6. Le tecnologie di visualizzazione dei fagi consentono la selezione di fagi che visualizzano peptidi biotinylati7,8. Poiché l’amplificazione di fagi isolati richiede l’infezione di un ospite batterico, tuttavia, la selezione dei fagi con streptavidina crea un collo di bottiglia in quanto il legame ad alta affinità della biotina alla streptavidina è praticamente irreversibile sotto non-denatura Condizioni. Per garantire il legame reversibile dei fagi biotinylati, sono stati utilizzati aftaepiine monomeriche con minore affinità che hanno portato a un modesto arricchimento di 10 volte7. Recentemente abbiamo sviluppato un metodo di visualizzazione batterica per l’isolamento delle nuove varianti BirA che elimina la necessità di eguagliare dalla matrice di affinità e quindi rimuove un collo di bottiglia dai precedenti sistemi di selezione BirA9. Infatti, il nostro sistema di visualizzazione batterico consente un >1,000.000 volte l’arricchimento di cloni attivi in un’unica fase di selezione9,fornendo così un sistema di selezione efficace per l’evoluzione diretta di nuove varianti BirA.
Il nostro sistema di visualizzazione batterica è costituito da due componenti, BirA con un terminale C 6xIl suo tag e una proteina scaffold che consente la visualizzazione superficiale di un peptide bersaglio. Abbiamo usato la proteina scaffold potenziata circolaremente permutata proteina della membrana esterna X (eCPX) poiché l’efficace visualizzazione dei peptidi può essere osservata sia al bi-termini N che a quello C10,11. La fusione della sequenza di peptidi di destinazione con il capo”C di eCPX assicura la biotinylaazione dei batteri che esprimono varianti BirA attive. I batteri consentono l’effettiva selezione di streptavidin come il peptide biotinylato ora visualizza sulla superficie (Figura 1a).
Lo scopo di questo metodo è quello di selezionare per nuove varianti di BirA che biotinylas sequenze di peptidi presenti nelle proteine native. Il sistema è codificato da geni presenti sul pBAD-BirA-eCPX-AP, che contiene un promotore arabo-inducibile che controlla BirA (araBAD), e un promotore T7 che controlla eCPX9 (Figura 1b). Il presente protocollo descrive la procedura dettagliata per 1) incorporazione di un peptide derivato da una proteina bersaglio nel terminale C di eCPX, 2) creazione di una libreria mutazionale di BirA mediante PCR soggetto a errori, 3) selezione di batteri leganti streptavidina lo smistamento cellulare attivato magnetica (MACS), 4) la quantificazione dell’arricchimento dei batteri e 5) la caratterizzazione iniziale dei cloni isolati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Come per tutti i metodi di selezione, la severità delle fasi di lavaggio è della massima importanza. Poiché i batteri non hanno bisogno di essere eluiti dalle perline prima dell’amplificazione dei cloni selezionati, l’alta affinità di legame tra biotina e streptavidina può essere utilizzata invece di utilizzare avidini di affinità inferiore, come precedentemente fatto con il sistema di visualizzazione dei faghi, per la selezione delle varianti BirA7,8. Ciò…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Mohamed Abdullahi Ahmed per l’assistenza tecnica esperta. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione Lundbeck, della Novo Nordisk Foundation, dell’Associazione danese dei reni, della Fondazione Aase og Ejnar Danielsen, della Fondazione A.P. M’ller per l’avanzamento della scienza medica e di Knud e Edith Eriksen Fondazione Memoriale.
Materials
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE – A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
Riferimenti
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