Visualizzazione e analisi del trasporto intracellulare di organelli e di altri carichi in Astrociti

Gli astrociti sono le cellule più abbondanti nel sistema nervoso centrale adulto, dove svolgono funzioni uniche di sviluppo e omeostatiche¹. Gli astrociti modulano lo sviluppo sinaptico attraverso il contatto diretto con terminali pre e post-sinaptici come parte della sinapsi tri-partita, che contiene recettori del neurotrasmettitore, trasportatori e molecole di adesione cellulare che facilitano la formazione di sinapsi e comunicazione neurona-astrocito². Inoltre, gli astrociti controllano attivamente la trasmissione sinaptica e prevengono l’eccitotossicità neuronale rimuovendo rapidamente i neurotrasmettitori eccitatori dalla fessura sinaptica, riciclando i neurotrasmettitori e partecipando alla potatura sinaptica^{3 , 4 DEL psu’ , 5} Del numero 3( ^{, 6.}Per consentire queste funzioni altamente interattive, gli astrociti comunicano tra loro, con altre cellule gliali, e con neuroni attraverso proteine di membrana specializzate, tra cui molecole di adesione cellulare, acquaporine, canali ionici, trasportatori di neurotrasmettitori e molecole di giunzione gap. Gli astrociti cambiano attivamente i livelli superficiali di queste proteine in risposta alle fluttuazioni nel loro ambiente intra- ed extracellulare⁷. Inoltre, i cambiamenti nei livelli e nella distribuzione dei mitocondri, delle goccioline lipidiche e degli organelli degradanti e di riciclaggio modulano l’approvvigionamento energetico, la disponibilità di metaboliti e i processi di compensazione cellulare essenziali per la funzione astrocite e sopravvivenza.

I cambiamenti dinamici nel traffico di proteine della membrana e degli organelli e nel posizionamento negli astrociti sono facilitati dalla funzione concertata di proteine motorie e adattatori che promuovono la motilità del carico^8,9. Allo stesso modo, i livelli superficiali delle proteine della membrana sono modulati attraverso eventi di internalizzazione e riciclaggio¹⁰. Questi carichi vengono trasportati attraverso un’intricata rete di actin, microtubuli, e possibilmente filamenti intermedi tracce⁸. Studi basati sull’colorazione immunofluorescenza della proteina di legame finale 1 (EB1), che si accumula al crescente microtubulo più estremità, suggeriscono che nei fasci di astrocicli di microtubuli si irradiano dal perinucleo ed estendono il loro periferia¹¹. Tuttavia, manca ancora un esame completo dell’organizzazione e della polarità dei microtubuli e di altri elementi citoscheletrici che utilizzano l’imaging a cellule vive. Mentre molti dei meccanismi alla base della dinamica degli organelli e delle proteine della membrana sono stati ampiamente studiati nei neuroni e in altri tipi di cellule, la motilità del carico negli astrociti è meno ben compresa. La maggior parte delle nostre attuali conoscenze sui cambiamenti nella distribuzione di proteine e organelli negli astrociti si basa sull’etichettatura tradizionale basata sugli anticorpi della preparazione fissa, che preclude un preciso esame spaziale e temporale delle dinamiche del carico^{7, 12}.

Qui, descriviamo un metodo per etichettare proteine e organelli di membrana per l’imaging dal vivo in colture di astrociti primari ad alta purezza. Utilizzando questo protocollo, forniamo esempi in cui monitoriamo la localizzazione dinamica delle proteine della membrana con etichettatura delle proteine fluorescenti verdi (GFP) negli astrociti trafetti, tra cui la proteina di giunzione gap connexin 43 (Cx43-GFP) e l’amminoacido eccitatorio trasporto 1 (EAAT1-GFP). Descriviamo anche l’uso di una sonda acidotropica fluorescente per visualizzare organelli acidi e seguire le loro dinamiche di traffico in astrociti vivi. Infine, dimostriamo come analizzare i dati time-lapse per estrarre e valutare i parametri di trasporto per i singoli carichi.