המחשה וניתוח של תחבורה תאיים של אורגלים וcargos אחרים באסטרוציטים

Astrocytes הם התאים השופעים ביותר במערכת העצבים המרכזית למבוגרים, שם הם מבצעים ייחודי התפתחותית פונקציות הומסטטיות¹. Astrocytes לווסת את ההתפתחות הסינפטית באמצעות מגע ישיר עם מסופים טרום ו פוסט סינפטית במסגרת סינפטה משולש, אשר מכיל קולטני הנוירוטרנסמיטר, מובילים, תא מולקולות הדבקה המקלים על היווצרות סינפסה והתקשורת האסטרוציטותא². בנוסף, האסטרוציטים באופן פעיל לשלוט שידור סינפטית ולמנוע מפני הזדקנות העצבים העצבית על ידי הסרה מהירה של נוירוטרנסמיטרים מתוך שסוע סינפטית, מיחזור נוירוטרנסמיטורים, והשתתפות בגיזום סינפטית^{3 , ד ,} מיכל ^{5 , 6}. כדי לאפשר אלה פונקציות אינטראקטיביות מאוד, האסטרוציטים לתקשר בינם לבין עצמם, עם תאים גליה אחרים, עם נוירונים באמצעות חלבונים ממברנה מיוחדים, כולל מולקולות הדבקה התא, aquפורטל, ערוצי יונים, מובילי הנוירוטרנסמיטר ומולקולות של צומת הפער. Astrocytes פעיל לשנות את רמות פני השטח של חלבונים אלה בתגובה תנודות בסביבה הפנים והחילוץ שלהם⁷. יתר על כן, שינויים ברמות והפצה של המיטו, טיפות ליפיד, ו degradative ומיחזור אורגלים לווסת את אספקת האנרגיה, זמינות מטבוליט, ותהליכי סליקה סלולריים החיוניים לפונקציה אסטרוציט ו ישרדות.

השינויים הדינאמיים בחלבון ממברנה ובסחר בנשים ומיצוב באסטרוציטים מקדמים את הפונקציה מתואמת של חלבונים ומתאמים מוטוריים המעודדים תנועתיות מטענים^8,9. באופן דומה, רמות פני השטח של חלבונים ממברנה מאופנן דרך הפנמה ומיחזור אירועים¹⁰. אלה מטענים מועברים באמצעות רשת מורכבת של actin, microtubules, ואולי ביניים רצועות שירים⁸. מחקרים המבוססים על כתמים immunofluorescence של הקצה מחייב חלבון 1 (EB1), אשר מצטבר על מיקרוכדורית הגוברת ומסתיים, מציע כי בצרורות אסטרוציטים של microtubules מקרין החוצה מתוך החוצה ולהאריך את קצה הפלוס שלהם לכיוון מפריפריה¹¹. עם זאת, בדיקה מקיפה של הארגון וקוטביות של microtubules ואלמנטים ציטולדים אחרים באמצעות הדמיה תא חי עדיין חסר. בעוד רבים של המנגנונים המשמשים את הדינמיקה של אורגלים וחלבונים ממברנה נחקרו בהרחבה בנוירונים וסוגי תאים אחרים, תנועתיות מטענים ב אסטרוציטים הוא פחות טוב מובן. רוב הידע הנוכחי שלנו על שינויים חלבון ו אורגונל התפלגות ב אסטרוציטים מבוסס על מסורתי נוגדן מבוסס תיוג של הכנה קבועה, אשר מונע בדיקה מרחבית וזמני מדויק של דינמיקה מטענים^7, . ^{שתיים עשרה}

כאן, אנו מתארים שיטה לתייג חלבונים הממברנה ואורגלים עבור הדמיה חיה בתרבויות גבוהה העכבר הראשי אסטרוציט הטוהר. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מספקים דוגמאות שבו אנו מעקב אחר הלוקליזציה הדינמי של חלבון פלורסנט ירוק (GFP)-מתויגים חלבונים ממברנה ב astrocytes הטרנסתאי, כולל הפער הפערים חלבון קונשין 43 (Cx43-GFP) ואת חומצת האמינו המתומנת טרנספורטר 1 (EAAT1-GFP). אנו גם לתאר את השימוש של החללית הניאון ac, בדיקה כדי להמחיש אורגלות חומצי ולעקוב אחר הדינמיקה שלהם הסחר בחיים astrocytes. בסופו של דבר, אנו להדגים כיצד לנתח את הנתונים לשגות זמן כדי לחלץ ולהעריך את הפרמטרים התחבורה עבור cargos בודדים.