Imaging ottico di miociti Murine Ventricolari isolati

Tutti i metodi e le procedure descritti in questo protocollo sono stati approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Case Western Reserve University. 1. Preparazione di soluzioni, strumenti e coverlips NOTA: 1x soluzioni possono essere utilizzate per un massimo di un mese. Fare 10x Krebs-Henseleit tampone HEPES buffer senza calcio (KHB-HB) con l’aggiunta di 68,96 g di NaCl, 3,57 g di KCl, 59,58 g di HEPES, 2,18 g di K2HPO4, 3,08 g di MgSO4 e 19,82 g di glucosio a 800 mL di acqua doppiettata in un pallone da 1.000 ml. Dopo che il contenuto è completamente sciolto, portare fino a volume in un flacone volumetrico da 1.000 ml.NOTA: La soluzione tradizionale Krebs Henseleit utilizza il bicarbonato di sodio come buffer e la soluzione in questo protocollo utilizza la soluzione Krebs Henseleit con buffer HEPES. La soluzione è stabile per 6 mesi se sterile filtrato. Rendere la soluzione di 10x Tyrode aggiungendo 86,51 g di NaCl, 0,552 g di NaH2PO4, 2,03 g di MgCl2, 9,91 g di glucosio, 4,03 g di KCl, 2,65 g di CaCl2e 35,76 g di HEPES a 800 mL di acqua doppia distillata in un pallone da 1000 mL. Dopo che il contenuto è completamente sciolto, portare fino a volume in un flacone volumetrico da 1000 ml.NOTA: La soluzione è stabile per 6 mesi se sterile filtrato. Fare 1x KHB-HB misurando 100 mL del brodo 10x e aggiungendo a 875 mL di acqua doppia distillata in un flacone da 1.000 mL. Mettere il flacone nel bagno d’acqua a 37 gradi centigradi. Una volta che la soluzione ha raggiunto i 37 gradi centigradi, utilizzare NaOH per aumentare il pH a 7,39. Dopo aver regolato il pH, portare la soluzione a volume in un flacone volumetrico da 1000 ml. Sterile filtrare la soluzione utilizzando un sistema di filtrazione sottovuoto. Crea la soluzione 1x Tyrode misurando 100 mL del brodo 10x e aggiungendo a 875 mL di acqua doppia distillata in un flacone da 1.000 mL. Mettere il flacone nel bagno d’acqua a 37 gradi centigradi. Una volta che la soluzione ha raggiunto i 37 gradi centigradi, utilizzare NaOH per aumentare il pH a 7,39. Dopo aver regolato il pH, portare la soluzione a volume in un flacone volumetrico da 1.000 ml. Filtro sterile utilizzando un sistema di filtrazione sottovuoto. Crea 1x modificata della soluzione di Tyrode misurando 100 mL del brodo 10x e aggiungendo a 875 mL di acqua doppia distillata in un flacone da 1.000 mL. Sciogliere 3,07 g di L-glutathione ridotto in fiaschetta. Mettere il flacone nel bagno d’acqua a 37 gradi centigradi. Una volta che la soluzione ha raggiunto i 37 gradi centigradi, utilizzare NaOH per aumentare il pH a 7,39. Dopo aver regolato il pH, portare la soluzione a volume in un flacone volumetrico da 1.000 ml. Sterile filtrare la soluzione utilizzando un sistema di filtrazione sottovuoto. Fare 100 mM di soluzione di scorta di blebbistatin aggiungendo 855 L di solforo dimetilo (DMSO) a 25 mg di polvere. Aliquota in incrementi di 20 l e conservare in un congelatore a -80 gradi centigradi per un massimo di sei mesi. Fare in modo che l’arresto buffer aggiungendo 2 g di albumina siero bovina (BSA) e 1 fiala di scarichetto di peliere e di 100 mL di 1x KHB-HB e filtro sterile della soluzione utilizzando un sistema di filtrazione a vuoto. Fare tampone di placcatura aggiungendo 5 mL di siero bovino fetale e 1 fiala dello stock di blebbistatin macchiato a 95 mL di M199 HEPES. Sterile filtrare la soluzione utilizzando un sistema di filtrazione sottovuoto. Fare buffer coltura miocite con l’aggiunta di una fiala 1 del brodo di blebbistatin e 4 mls penicillina-streptomycin a 396 mL di M199 (25 mHe HEPES). Sterile filtrare la soluzione utilizzando un sistema di filtrazione sottovuoto. Autoclave 2 paia di pinzette Dumont, 2 paia di forbici curve Iris, 2 hemostats, un paio di pinze chirurgiche plastiche, 6 suture di seta intrecciata nera 4-0 disposte per essere utilizzate come nodo chirurgico a doppio lancio e quattro becher da 100 mL. Sterilizzare 22 x 22 mm2 coperture in vetro. In primo luogo, posizionare una singola coverslip in ogni pozzo di un sei pozzetti. Successivamente, con il coperchio rimosso, accendere la lampada UV dell’armadio di biosicurezza ed esporre i copricoperture alla luce UV per 1 h. Rendere la soluzione di supporto laminale di lavoro scongelando prima la bottiglia sul ghiaccio. Aggiungere il contenuto di una bottiglia a un numero sufficiente di salina sterile con buffer di fosfato (PBS) per raggiungere una concentrazione finale di 0,04 mg/mL. Aliquota 1,3 l in tubi di centrifuga autoclavi da 1,5 ml. Conservare a -80 gradi centigradi.NOTA: Ogni tubo ha abbastanza laminina per un singolo piatto a sei pozzetto. Evitare più cicli di congelamento del blocco. Cappotto in vetcino sterilizzato scongelando prima la soluzione di laminina di lavoro sul ghiaccio. Utilizzando una pipetta P1000, aspirare 200 l di laminina. Trascinare delicatamente la punta della pipetta lungo un bordo della coverslip per consentire all’azione capillare di estrarre una minuscola quantità di lamina per facilitare l’attaccamento coverslip alla piastra sei pozzetti. Quindi, espellere la laminina rimanente al centro della coverslip. Con un movimento circolare, stendete la goccia di laminina sulla vesserata. Mettere in un’incubatrice di 37 gradi centigradi almeno 1 h e fino a 24 h prima dell’isolamento. 2. Preparazione del Langendorff Apparatus NOTA: i singoli componenti dell’apparato Langendorff utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei materiali. Accendere il bagno d’acqua circolante. Impostare la temperatura in modo che il perfusate abbia una temperatura di 37 gradi centigradi.NOTA: Con i serbatoi di soluzione impostati ad un’altezza di 60 cm, il parto in acqua circolante deve essere impostato a 41 gradi centigradi per far in modo che il perfusate sia di 37 gradi centigradi. A differenza dei protocolli precedentemente riportati, l’altezza del serbatoio non deve essere modificata. Risciacquare l’apparato Langendorff con il 70% di etanolo seguito da due risciacquo con acqua a doppia distillata autoclata. Dopo il risciacquo, riempire il serbatoio con KHB-HB e ossigenare con ossigeno 100%. Prime il sistema permettendo a KHB-HB ossigenato di fluire per la prima volta in un becher da 100 mL. Una volta che 50 mL di soluzione è fluito nel becher, passare la posizione stop-cock a 3 vie per fermare il flusso dal serbatoio KHB-HB. Versare 50 mL di KHB-HB ossigenato dal becher nel serbatoio di collagenae. Lasciare lo scarico KHB-HB dal serbatoio di digestione fino a 5 mL rimane nel serbatoio di collagenae. Durante l’innesco serbatoio di collagenae, passare il cazzo arresto a 3 vie ripetutamente tra i serbatoi per consentire alle linee di degas. Dopo che il sistema è innescato, ricordarsi di utilizzare la trappola di degassamento situata sulla parte superiore della bobina di riscaldamento per consentire all’aria rimanente di uscire dal sistema. Rendere la soluzione collagenasi. Per i ratti combinano 100 mg di collagenae di tipo II, 100 mL di KHB-HB ossigenato e 2 fiale dello stock di blebbistain. Per i topi, combinare 100 mg di collagenasi di tipo II, 40 mL di KHB-HB ossigenato e 2 fiale dello stock di blebbistain. Una volta miscelata, la soluzione dovrebbe essere stabile per 1 h.NOTA: La fattibilità dei miociti può variare tra i lotti di collagenasi di tipo II. Approfitta di un programma di campionamento di collagenasi per testare molto prima dell’ordine in blocco. 3. Isolamento dei miociti Iniettare all’animale 1.000 U di eparina. Attendere 5 min.NOTA: È possibile utilizzare topi e ratti di qualsiasi età. Tuttavia, in generale l’animale più vecchio o più malato, minore è la resa dei miociti. Sacrificare l’animale anestizzandolo con isoflurane utilizzando il metodo open-drop (1 cc di Isoflurane per volume 500 cc) prima di eutanasia l’animale con una miscela pentobarbitale (150 mg/kg intraperitoneale). Rapidamente eccitare il cuore afferrando prima la pelliccia sopra il processo xifoideo. Con le forbici iride, fare una piccola incisione immediatamente sotto il processo xifoide e tirare la pelliccia verso l’alto verso la testa esponendo la pelle. Afferrare il processo xifoideo e tagliare il diaframma esponendo la cavità toracica. Fare un’incisione porta trappola, tirare indietro lo sterno utilizzando un estrostato, e utilizzare le pinze curve per eccitare il cuore sopra l’aorta ascendente e posto in freddo KHB-HB. Cannula il cuore usando un microscopio stereo e le pinze numero 5. Assicurarsi che il cuore sia sommerso e che la cannula sia stata innescata prima dell’escissione cardiaca per prevenire gli emboli. Confermare il corretto posizionamento della cannula visualizzando la punta della cannula circa 1 mm sopra l’inserimento aortico nel ventricolo.NOTA: più veloce è il tempo di conulazione, migliore è la resa del miocito. Avviare il flusso di KHB-HB ruotando il tappo sul Langendorff. Collega la cannula al Langendorff. Confondere il cuore per 5 min.NOTA: Poiché la perfusione è fornita da un sistema basato sulla gravità, il flusso attraverso il cuore sarà una funzione della conformità coronarica. Passare alla perfusione dal serbatoio KHB-HB al serbatoio del tampone di digestione. Una volta che il buffer di digestione raggiunge il cuore, impostare un timer (5 min per il topo o 15 min per il ratto). Assicurarsi di raccogliere il perfusate in uno sterile becher da 100 mL. Ricaricare il serbatoio del buffer di digestione in base alle esigenze con il perfusate fino alla scadenza del tempo di digestione. Dopo la digestione, separare le camere del cuore con le pinze e le forbici dell’iride in uno sterile becher da 100 mL. Mettere ogni camera in un pozzo separato di un piatto di sei pozze. Versare 5 mL di soluzione di collagenasi in ogni pozzo. Iniziare immediatamente a mincing il tessuto cardiaco utilizzando le forbici. I pezzi di tessuto devono essere di circa 1 mm3. Utilizzando sterili pipette di trasferimento, triturare delicatamente il tessuto cardiaco macinato. La soluzione dovrebbe diventare nuvolosa. Una volta che i pezzi di tessuto diventano bianchi e piumati, esaminare le cellule utilizzando un microscopio invertito. Se il numero di cellule vitali è superiore all’80%, procedere a filtrare le cellule in un tubo conico da 50 mL utilizzando un colino cellulare di 100 m. Utilizzare un tubo e un colino diversi per ogni camera del cuore. Se il numero di cellule vitali è inferiore all’80%, controllare il tempo necessario per cannulare. Se il tempo di canonulazione è superiore a 5 min, provare un altro cuore. In caso contrario, risalutar nuovi lotti di collagenasi attraverso il programma di campionamento del collagena. Pellet le cellule da centrifugiare a 215 x g per 2 min. Il pellet deve essere compatto e non sciolto. Se il pellet è allentato, la preparazione contiene molte cellule morte. In un cofano di coltura tissutale, risospendere il pellet in 10 mL di arresto tampone. Pellet le cellule da centrifugiare a 215 x g per 2 min. Il pellet deve essere compatto e non sciolto. Se il pellet è allentato, la preparazione contiene molte cellule morte. Risospendere le celle in 5 mL di tampone di placcatura. Eseguire un conteggio delle celle. Regolare i millilitri di tampone di placcatura per raggiungere una concentrazione finale di miociti di 2 x 104 cellule per mL. Togliere i coperchi rivestiti di laminina dall’incubatrice. Aspirare la goccia di laminin. Piastra 200 -L di sospensione miocyte su ogni coverslip. Mettere in un incubatore di 37 gradi centigradi (21% O2, 5% CO2)per 2 h per consentire l’attaccamento. Dopo 2 h, aspirare le celle non attaccate, aggiungere 2 mL di supporti di coltura e coltura per un massimo di 4 giorni. 4. Fura-2 Caricamento coloranti Fare una soluzione di stock da 2 mm fura-2 acetoxymethyl ester (fura-2 AM) aggiungendo 25 -L di DMSO a 50 g di polvere di fura-2 AM (1 fiala). Aliquota in 6 aliquote ll. Prendere 1 aliquota di fura-2 AM e aggiungere a 6 mL di mezzo di placcatura. Vortice da mescolare. Rimuovere 1 sei pozzetto di miociti dall’incubatrice. Media aspirati. Aggiungere 1 mL di miscela di supporti fura-2 ad ogni pozzo. Coprire la piastra con un foglio, lasciare la piastra a temperatura ambiente e attendere 15 min. Aspirate miscela di supporti e aggiungere 1 mL della soluzione di Tyrode ad ogni pozzo. Coprire con un foglio. Attendere 20 min a temperatura ambiente per consentire il lavaggio dei tini prima dell’imaging. 5. Caricamento dye Fluo-4 Fare una soluzione di riserva di 1,82 mM di fluo-4 acetoxymethyl ester (fluo-4 AM) aggiungendo 25 L di DMSO a 50 g di polvere di fluo-4 AM (1 fiala). Aliquota in 8.333 l’aliquota. Prendere 1 aliquota di scorta di fluo-4 AM e aggiungere a 6 mL di mezzo di placcatura. Vortice da mescolare. Rimuovere 1 sei pozzetto di miociti dall’incubatrice. Media aspirati. Aggiungere 1 mL di miscela di sfumino-4 AM ad ogni pozzo. Coprire la piastra con un foglio, lasciare la piastra a temperatura ambiente e attendere 15 min. Aspirate miscela di supporti fluo-4 AM e aggiungere 1 mL della soluzione di Tyrode ad ogni pozzo. Coprire con un foglio. Attendere 20 min a temperatura ambiente per consentire il lavaggio dei tini prima dell’imaging. 6. Caricamento del potenziale della membrana Rimuovere il componente A e il componente B dal kit potenziale della membrana. In un tubo conico da 15 mL, unire 50 -L del componente B e 5 l del componente A. Vortex da mescolare. Aggiungere 10 mL di supporto di placcatura al tubo conico da 15 mL contenente la miscela di colorante di tensione. Vortice da mescolare. Rimuovere 1 sei pozzetto di miociti dall’incubatrice. Aspirare i media. Aggiungete 800 l della miscela di tintura potenziale della membrana ad ogni pozzo. Coprire la piastra con un foglio, lasciare la piastra a temperatura ambiente e attendere 15 min. Aspirare miscela di supporti coloranti e aggiungere 1 mL di soluzione modificata-Tyrode ad ogni pozzo. Coprire con un foglio. 7. Fotometria e carica Registrazioni dispositivo accoppiato Accendere l’apparecchiatura nel seguente ordine: microscopio, lampada ad arco, iperinterruttore, sistema di interfaccia a fluorescenza, alimentazione Myocam, stimolatore sul campo e computer. Assicurarsi che i set di filtri di eccitazione/emissione siano appropriati per il tinrito di imaging.NOTA: Fura-2 è entusiasta a 340 nm e 380 nm di luce. Emette a 510 nm di luce. Fluo-4 e il coloranti a membrana di tensione sono entusiasti a 485 nm di luce ed emettono a 520 nm di luce. Prime il sistema accendendo il vuoto, aprendo completamente il morsetto del tubo flessibile e immergendo delicatamente ogni siringa da 60 mL utilizzata nel collettore. Per le registrazioni di calcio utilizzare la soluzione di Tyrode. Per le registrazioni di tensione utilizzare la soluzione di Tyrode modificata. Accendere il riscaldatore e impostare il flusso regolando il morsetto del rullo sul tubo perfusione. Effettuare registrazioni a 36 x 1 gradi centigradi. Aprire il software di acquisizione. Assicurarsi che i parametri siano impostati per il tinrito di imaging corretto. Al buio, rimuovere la pellicola dalla piastra sei pozzo e posizionare un coperchio nella camera di stimolazione. Assicurarsi che lo stimolatore sia spento durante questo passaggio. Concentrati sui miociti usando l’obiettivo 10x. Una volta a fuoco, iniziare a camminare stimolando il campo a 1 Hz, 0,2 V. Aumentare gradualmente la tensione fino a ottenere il ritmo 1:1. Quindi aumentare la tensione fino a 1,5x viene raggiunta la soglia.NOTA: Poiché l’accoppiamento di contrazione eccitazione dipende dalla temperatura, assicurarsi che le cellule siano state perfuse per 15 min prima della registrazione. Questo permette ai miociti di riprendersi dallo shock di passare dalla temperatura ambiente a 37 gradi centigradi, così come le cellule vagamente attaccate a galleggiare via. Passare dall’obiettivo 10x all’obiettivo 40x. Concentrarsi su una cella che segue una stimolazione 1:1. Regolare le sfumature di plastica in modo che solo una cella sia nel campo visivo. Utilizzando il software, posizionare l’area di interesse box su sarcomere ben definiti. Avviare il software di acquisizione per avviare la luce di eccitazione. Utilizzando i filtri a densità neutra, regolare di conseguenza l’impostazione dell’intensità per ottenere un SNR adeguato.