Mantar-Konak Etkileşimini Incelemek için Farelere Malassezia spp.

Bu protokolde tanımlanan tüm prosedürler, İsviçre Federal Çevre Dairesi’nin (www.bafu.admin.ch) içerdiği sistemlerde organizmaların taşınmasına ilişkin yönetmelik uyarınca gerçekleştirilmiştir. Fare deneyleri İsviçre Hayvanları Koruma Kanunu’nun kurallarına uygun olarak yapılmış ve İsviçre’nin Zürih Kantin I.Ş. Veteriner Lik Ofisi tarafından onaylanan protokoller uyarınca yapılmıştır (lisans numarası 168/2018). 1. Laboratuvar koşullarında Malassezia ekimi NOT: Düşük sıcaklık mantar büyümesini engelleyebilir gibi, aksi belirtilmedikçe oda sıcaklığında (RT, 20 – 25 °C) bu protokol için kullanılan tüm reaktifleri ve ortamları saklayın. Malassezia büyüme için sıvı modifiye Dixon (mDixon) orta hazırlayın. Sıvı mDixon orta 500 mL hazırlamak için, 18 g Malt ekstresi, 10 g kurutulmuş Öküz-safra, 5 mL Tween-40, 3 g Peptone, 1 mL Gliserol ve 1 mL Oleik Asit 500 mL distile H2O (dH2O) çözünür. HCl ve otoklav ile pH 6 orta ayarlayın. Ortamı RT’de saklayın. Otoklavlama dan önce 500 mL mDixon ortamına 7,5 g agar ekleyerek mDixon agar plakalarını hazırlayın. Soğuma sırasında ortamın kısmi katılaşmasını önlemek için bir direksiyon çubuğu ve manyetik ısıtma plakası kullanarak otoklavladıktan sonra mDixon agarını yavaşça soğutun. Agar 50 -60 °C’ye kadar soğuduktan sonra, sıvıyı laminar akış kaputunda Petri yemeklerine dağıtın ve bir gecede RT’de kurumasını bekleyin.NOT: Agar plakaları buharlaşmayı önlemek için 4 °C’de paketlenerek baş aşağı tutularak birkaç hafta saklanabilir. Malassezia’yı elde edin ve sağlayıcı tarafından alınan talimatlara göre Malassezia’nın lyophilized stoklarını canlandırın. 10 mL likit mDixon ortasını steril 100 mL Erlenmeyer şişesinde, sağlayıcının aldığı talimatlara göre yeniden canlandırılan Malassezia süspansiyonu ile aşılayın. Kültürü 30 °C ve 180 rpm’de sallayarak bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın. Krem rengi ve bulanıklık görünümünü kontrol ederek düzenli olarak Malassezia kültürünün büyüme inceleyin. Büyüme kinetik türleri ve Malassezia suşu bağlıdır ve Malassezia taze bir lyophilized stok canlandırılır zaman özellikle yavaş olabilir. (Şekil 1A). Steril 1 parçası ile mDixon orta yoğun yetiştirilen Malassezia kültürünün 3 parçaları karıştırarak gliserol stokları hazırlayın 99% gliserol. Aliquot Malassezia/ gliserol karışımı steril vida-kapak tüpler imal ve saklamak -80 °C. In vitro proporsiyon için, mDixon sıvı kültüründen veya dondurulmuş gliserol stokundan bir mDixon agar plakasına (4 °C’den RT’ye getirilen) bir aşılama döngüsü kullanarak Malassezia plakası.NOT: Soğuk mDixon agar mantar büyümesini engellediğinden, mDixon agar plakalarını kullanımdan önce 4 °C’den RT’ye aktarın. Agar plakasını (ler) Malassezia ile baş aşağı 30 °C’de (sallamayan) bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın. Düzenli olarak Malassezia kolonilerinin büyümesini inceleyin.NOT: mDixon agar plakaları üzerindeki Malassezia kolonileri 3 – 5 gün içinde görünür ve krem renkli donuk, konveks yüksekliği ile pürüzsüzdür(Şekil 1B). Yaklaşık 2 hafta boyunca RT mDixon agar plakaları üzerinde Mağaza Malassezia kolonileri. Bundan sonra, 1.7 açıklandığı gibi dondurulmuş gliserol stok Malassezia çizgili tarafından yeni bir mDixon agar plaka hazırlamak. 2. Farelerin deneysel Malassezia enfeksiyonu için inokül hazırlanması Steril 100 mL Erlenmeyer şişesinde 10 mL sıvı mDixon orta inoküle 3 – 5 bireysel Malassezia kolonileri bir mDixon agar plaka (bkz. adım 1, Şekil 1B). Malassezia kültürünü 30 °C’de ~ 48-96 h ve 180 rpm için kuluçkaya yatırın, ta ki kültür krem renkli ve bulanık olana kadar(Şekil 1A).NOT: Malassezia büyümesi için gerekli zaman Malassezia türleri ve suşu ve aşılama için kullanılan mantar miktarına bağlıdır. Malassezia kültürünün 2 mL’sini steril 2 mL mikrosantrifüj tüpe ve santrifüje 1 dk 10, 000 x g’de aktarın. Supernatant atın ve fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) 1 mL askıya alarak pelet yıkayın. Santrifüj tekrar 1 dk 10, 000 x g. Yıkamadan sonra peleti 1 mL PBS’de güçlü pipetleme ile askıya alın ve çözeltinin optik yoğunluğunu 600 nm ‘de (ODA600)bir spektrometre kullanarak ölçün. Okuma0.1 ve 1 arasında olduğundan emin olmak için OD ölçümü için PBS ile Malassezia süspansiyon 20 – 50 x seyreltin.NOT: Malassezia’nın 3 günlük kültürünün yoğunluğu genellikle Malassezia türlerine ve zorlanmalarına ve kültürün aşılanmasında kullanılan maya hücrelerinin sayısına bağlı olarak 15 ila 30 ODA600arasında değişmektedir (adım 2.1). Malassezia agregalar oluşturmak eğilimindedir, bu nedenle, güçlü pipetleme süspansiyon homojenliğini sağlamak için gereklidir. Aliquot steril bir 2 mL tüp içine 4 ODA600 yoğunluğuna karşılık gelen PBS Malassezia süspansiyon hacmi. Enfekte olmak için hayvan başına 1 tüp hazırlayın. 10, 000 x g 1 dakika Malassezia içeren tüpler santrifüj. Supernatant atın ve yerli zeytinyağı 200 μL (2 ODA600 maya hücreleri/100 μl zeytinyağı karşılık gelen) Malassezia peletaskıya.NOT: Zeytinyağı Malasseziaile epiutaneöz enfeksiyon için iyi bir araç olduğu bulunmuştur , Malassezia bir lipophilic ve lipid bağımlı maya olduğu gibi. Zeytinyağı pbs daha iyi cilt tarafından emilir. Ancak, zeytinyağı Malassezia askıya almak kolay olmadığını unutmayın. Girdap tarafından Malassezia/ zeytinyağı süspansiyon geliştirin. Enfeksiyon için kullanılana kadar süspansiyonu RT’de tutun. Kontrol hayvanlarının sahte enfeksiyonu için tüpleri tek başına zeytinyağı ile hazırlayın. 3. Malassezia ile farelerin enfekte Sipariş kadın C57BL/6 fareler yaş 6 – 8 hafta ve onları en az bir hafta için deneysel hayvan tesisinde alışmak için izin. Enfekte olmayan bir kontrol grubu da dahil olmak üzere grup başına 3 – 5 fare hesaplayın. PBS’de 1.3 mg/mL Ksilazin ve 6.5 mg/mL Ketamin içeren steril anestezik kokteyl hazırlayın. Anestezikokteylinin 5 mL’si 20 hayvanı anestezik etmek için yeterlidir. Anestezi edilecek hayvan sayısına göre kokteylin hacmini ayarlayın. Anestezik kokteylin 10 μL/g vücut ağırlığını intraperitoneal olarak enjekte ederek hayvanları anestezi edin (vücut ağırlığı başına 65 mg Ketamin ve 13 mg Xylazine’ye karşılık gelir) ve anestezi altındaki hayvanları 37 °C’de bir ısıtma yastığına yerleştirin.NOT: Belirtilen dozda hayvanlar genellikle ~ 30 – 60 dk için anestezi kalır. Hayvanların tamamen anestezi olduğundan emin olmak için arka ayağı forceps ile çimdikleyerek refleksleri kontrol edin. Anestezi sırasında dehidratasyon önlemek için gözlerüzerine bir göz kremi uygulayın. İsteğe bağlı olarak, kaliper (0 – 5 mm aralık) kullanarak her iki kulağın da kulak kalınlığını ölçün. Her kulağın iki farklı alanını ölçün ve kulak başına ortalama kulak kalınlığını hesaplayın.NOT: Kulak kalınlığının ölçülmesi isteğe bağlıdır ve araştırma sorusuna bağlıdır. Ancak, kulak kalınlığı cilt iltihabı için bir okuma olarak kullanılırsa, enfeksiyon önce temel kulak kalınlığı ölçmek için gereklidir. (bkz. Adım 4). İsteğe bağlı olarak, hafif bant sıyırma ile sırt kulağı derisinin epidermal bariyerini bozun: el ile cilde bant küçük bir parça uygulayın ve tekrar kaldırın. Her tur için yeni bir bant parçası kullanarak art arda 5 tur için tekrarlayın.NOT: Malassezia engelsiz cilde göre bariyer bozulmuş deride daha belirgin bir deri iltihabına neden olur (Şekil 2A)7. Topikal bir steril pipet kullanarak her kulağın dorsal tarafına Malassezia/ zeytinyağı süspansiyon 100 μL (2 ODA600)uygulayın. Sadece zeytinyağı ile tedavi edilen bir kontrol grubu (araç la tedavi edilen kontrol grubu) ekleyin.NOT: Vortex Malassezia/ zeytinyağı süspansiyon şiddetle uygulamadan hemen önce homojen malassezia süspansiyon sağlamak için. Onlar iyileşme belirtileri gösterene kadar hipotermi önlemek için ısıtma yastığı üzerinde anestezi hayvanları bırakın (bıyık hareketi, artan solunum hızı, vb). Metabolizmalarını ve rehidrasyonlarını desteklemek için 200 μL steril ve önceden ısıtılmış %2’lik glikoz çözeltisini nuchal kıvrımına deri altı enjekte edin.NOT: Steril %2 glikoz çözeltisi hazırlamak için 50 mL PBS’de 1 mg glikozu eritin ve 0,2 μm filtre kullanarak filtreleyin. Çözelti 4 °C’de saklanabilir. Hayvanları kafeslerine geri transfer edin. 4. Malasseziaanalizi -indüklenen deri iltihabı NOT: Bu işlem, deri iltihabı bir parametre olarak hizmet veren enfeksiyon sırasında Malasseziakaynaklı kulak şişmesi analizi açıklar. Mantarkaynaklı kulak şişmesini analiz etmek için ön koşul, bant sıyırma ve/veya enfeksiyondan önce temel kulak kalınlığını ölçmektir (Adım 3.5). Malassezia-enfekte ve kontrol hayvanların kısa süreli anestezi için isoflurane odası hazırlayın. Bir hayvanı odaya aktarın ve hayvanın tamamen anestezi sini bekleyin.NOT: Uygun anestezi belirtileri tam vücut gevşemeyanı yanı sıra yavaş ve ağır (yan) nefes içerir. Isoflurana uzun süreli maruz kalma ölümcül olabileceğinden anesteziyi dikkatle izleyin. Hayvanı odadan çıkarın ve bir doku üzerine yerleştirin. Kulak(lar) kalınlığını bir kaliper (dağılım 0 – 5 mm) kullanarak ölçün. Her kulağın iki farklı alanını ölçün ve kulak başına ortalama kalınlığı hesaplayın (bkz. adım 3.5). Hayvanı kafese geri aktar.NOT: Isoflurane anestezi çok kısa ömürlüdür ve hayvanlar isofluran odasından çıkarıldıktan sonra ~ 30 s içinde iyileşirler. Bant sıyırma ve/veya enfeksiyondan önce ölçülen ortalama taban çizgisi kulak kalınlığını, enfeksiyon sonrası her zaman noktasında ölçülen ortalama kulak kalınlığından çıkararak kulak kalınlığındaki artışı hesaplayın. Hesaplanan değerleri, kulak kalınlığındaki artış olarak veya alternatif olarak, her hayvan veya hayvan grubu için zaman içinde toplam kulak kalınlığı olarak çizin(Şekil 2B). 5. Enfekte ciltteki mantar yükünün analizi Hasat edilecek her kulak için 0,5 mL steril %0,05 NP40 içeren steril2mL mikrosantrifüj tüp ve otoklavlı çelik top (5 mm çapında) hazırlayın. Hassas bir denge kullanarak tüpleri tartın ve hassas ağırlığı yazın. Co2 boğulma ile fareler ötenazi. 5.1 – 5.2 adımlarında açıklandığı gibi, tabandaki kulağı çıkarın ve dH2O’da %0,05 NP40 steril 0,5 mL içeren tüpe aktarın. Kulak dokusunu içeren tüpü tartın ve organla birlikte tüpün ağırlığından organ olmadan tüpün ağırlığını çıkararak her bir örneğin gerçek ağırlığını hesaplayın. Bir doku homogenizer kullanarak 25 Hz 6 dakika için kulak dokusu homojenize. Dokunun iyi homojenolduğundan emin olun. Her numunenin 100 μL plakası (her homojenin 1/5’ine karşılık gelen, seyreltme faktörü = 5) mDixon agar plakalarına ve plakaları baş aşağı 30°C’lik bir kuluçka makinesine kuluçkaya yatırın.NOT: Homojen kaplama miktarı beklendiği mantar yüküne göre ayarlanmalıdır. Kolay numaralandırma sağlamak için plaka başına en az 10 ve en fazla 250 koloni elde etmek için yeterli homojen plaka emin olun. İsteğe bağlı olarak, homojen farklı seyreltmeler ile örnek başına plaka birden fazla plaka. Düzenli olarak Malassezia kolonilerinin büyümesini inceleyin.NOT: Koloniler genellikle 2 – 3 gün sonra görünür hale gelir. Malassezia kolonileri için gerekli zaman malasseziatürü ve suşu bağlıdır. Plaka başına kolonileri say. Aşağıdaki formülü kullanarak CFU/g doku sayısını hesaplayın:CFU/g doku = (koloni sayısı/plaka) x (seyreltme faktörü) / (g deri örneğinin ağırlığı).NOT: Yaklaşık minimum algılama sınırı aşağıdaki formül kullanılarak değerlendirilebilir: minimum algılama limiti = (1 koloni/plaka) x (seyreltme faktörü) / (g’deki tüm deri örneklerinin ortalama ağırlığı). Mantar yükleri genellikle logaritmik ölçekte çizilir (Şekil 2C).