感染小鼠与马拉塞齐亚spp.研究真菌-主机相互作用

本议定书所述的所有程序均根据瑞士联邦环境局（www.bafu.admin.ch）关于处理所含系统生物的法令执行。小鼠实验严格按照《瑞士动物保护法》的指导方针进行，并根据瑞士苏黎世州兽医局批准的协议（许可证号168/2018）进行。 1. 在实验室条件下种植马拉塞齐亚 注：除非另有说明，否则在室温（RT，20~25°C）下储存用于该协议的所有试剂和介质，因为较低的温度会抑制真菌生长。 为马拉塞齐亚的生长准备液体改性狄克逊（mDixon）介质。要制备 500 mL 的液体 mDixon 培养基，在 500 mL 蒸馏 H2O （dH2O） 中溶解 18 g 麦芽提取物、10 g 干燥牛胆、5 mL Tween-40、3 g 肽、1 mL 甘油醇和 1 mL 油酸。使用 HCl 和高压灭菌器将介质调整到 pH 6。将介质存储在 RT 上。 在高压灭菌之前，将 7.5 g 琼脂添加到 500 mL mDixon 介质中，准备 mDixon 琼脂板。使用转向杆和磁性加热板进行高压灭菌后，缓慢冷却 mDixon agar，以避免介质在冷却时部分凝固。 一旦琼脂冷却到50~60°C，将液体放入层流罩中的培养皿中，在RT处过夜晾干。注：琼脂板在包装后可在4°C下储存数周，并倒置保存，以避免蒸发。 根据提供者获得的指示，获得马拉塞齐亚分离和恢复马拉塞齐亚的冻干性储存。 接种10 mL液体mDixon介质在无菌100 mL Erlenmeyer烧瓶与恢复的马拉塞齐亚悬浮液根据供应商获得的指示。在30°C和180 rpm 的摇动培养箱中孵育培养体。 定期检查马拉塞齐亚文化的生长情况，检查奶油色和浊度的外观。生长动力学取决于马拉塞齐亚的物种和菌株，当马拉塞齐亚刚从冻干动物中恢复时，可能特别缓慢。（图1A） 通过在 mDixon 介质中混合 3 个密集生长的马拉塞齐亚培养部分与无菌 99% 甘油的 1 部分，制备甘油库存。将马拉塞齐亚/甘油混合物加入无菌螺帽管，并储存在-80°C。 对于体外繁殖，板马拉塞齐亚从液体培养在mDixon或从冷冻甘油股票到mDixon琼脂板（从4°C带到RT）使用接种回路。注意：在使用前将 mDixon 琼脂板从 4°C 转移到 RT，因为冷 mDixon 琼脂会抑制真菌生长。 在30°C的（非摇动）培养箱中，用马拉塞齐亚倒置孵育琼脂板。定期检查马拉塞齐亚殖民地的生长情况。注：mDixon琼脂板上的马拉塞齐亚菌落在3-5天内出现，呈奶油色沉闷，光滑，凸高（图1B）。 在RT的mDixon琼脂板上储存马拉塞齐亚菌落，为期2周。此后，准备一个新的mDixon琼脂板，从冷冻甘油库存中条纹马拉塞齐亚，如1.7所述。 2. 为实验小鼠马拉塞齐亚感染的接种准备 在无菌的 100 mL Erlenmeyer 烧瓶中接种 10 mL 的液体 mDixon 介质，从 mDixon agar 板中使用 3 – 5 个单独的马拉塞齐亚菌落（参见步骤 1，图 1B）。 在 30°C 和 180 rpm 下孵育马拉塞齐亚培养基为 + 48 至 96 小时，直到培养体呈奶油色和浑浊（图 1A）。注：马拉塞齐亚生长所需的时间取决于马拉塞齐亚的物种和菌株以及用于接种的真菌数量。 将2 mL的马拉塞齐亚培养基转移到无菌的2 mL微离心管中，并在10，000 x g下1分钟进行离心机。 丢弃上清液，在1mL的磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）中悬浮，洗净颗粒。在10，000 x g下再次离心1分钟。 洗涤后，通过强力移液将颗粒悬浮在1 mL的PBS中，并使用光谱仪测量溶液在600nm（ODA600）处的光密度。用 PBS 稀释马拉塞齐亚悬浮液 20 × 50 x 进行 OD 测量，以确保读数介于 0.1 和 1 之间。注：马拉塞齐亚3天培养的密度一般在15至30 ODA600之间，取决于马拉塞齐亚的物种和菌株以及用于培养菌接种的酵母细胞的数量（步骤2.1）。马拉塞齐亚倾向于形成骨料，因此，大力移液是必要的，以确保悬浮液的同质性。 在 PBS 中，将相当于 4 ODA600的密度的Malassezia悬浮液的体积与无菌 2 mL 管中一量相一致。准备每只动物1管被感染。 在10，000 x g下将含有马拉塞齐亚的管子离心1分钟。 丢弃上清液，将马拉塞齐亚颗粒悬浮在200 μL的原生橄榄油中（对应于2个ODA600酵母细胞/100μl橄榄油）。注：橄榄油被发现是表皮感染马拉塞齐亚的好工具，因为马拉塞齐亚是一种亲脂和脂质依赖酵母。橄榄油比PBS更能被皮肤吸收。但是，请注意，在橄榄油中暂停马拉塞齐亚并非易事。通过涡旋改善马拉塞齐亚/橄榄油悬浮液。将悬浮液保持在RT处，直到用于感染。 单独用橄榄油准备管子，用于对照动物的模拟感染。 3. 用马拉塞齐亚感染小鼠 在6-8周的年龄订购雌性C57BL/6小鼠，并允许它们在实验动物设施中适应至少一周。计算每组3 – 5个小鼠，包括未感染的对照组。 在PBS中制备含有1.3毫克/mL西拉辛和6.5毫克/mL氯胺酮的无菌麻醉鸡尾酒。5 mL的麻醉鸡尾酒足以麻醉20只动物。根据要麻醉的动物数量调整鸡尾酒的体积。 通过注射10μL/g麻醉动物的麻醉鸡尾酒内渗透（对应于65毫克氯胺酮和13毫克西拉辛每公斤体重），并将麻醉动物放在加热垫上，在37°C。注：在指示剂量下，动物通常保持麻醉30 – 60分钟。 检查反射，用钳子捏后脚，以确保动物完全麻醉。 在眼睛上涂上眼霜，防止麻醉过程中脱水。 或者，使用卡钳（0 – 5 mm 范围）测量两只耳朵的耳朵厚度。测量每个耳朵的两个不同区域，并计算每只耳朵的平均耳朵厚度。注：测量耳朵厚度是可选的，取决于研究问题。但是，如果耳朵厚度用作皮肤炎症的读出，则有必要在感染前测量基线耳部厚度。（请参阅步骤 4）。 或者，通过温和的胶带剥离来破坏背耳皮肤的表皮屏障：手动将一小块胶带涂在皮肤上，然后再次将其去除。在每轮使用一块新鲜的胶带连续重复5次。注：与未受干扰的皮肤相比，马拉塞齐亚在屏障破坏的皮肤中诱发更明显的皮肤炎症（图2A）7。 使用无菌移液器将马拉塞齐亚/橄榄油悬浮液的 100 μL （2 ODA600）局部涂抹到每个耳朵的背侧。包括仅使用橄榄油处理的动物对照组（车辆处理对照组）。注：涡旋马拉塞齐亚/橄榄油悬浮液，以确保在应用前立即进行同质的马拉塞齐亚悬浮液。 将麻醉动物留在加热垫上，以避免体温过低，直到它们出现恢复迹象（胡须运动、呼吸速率增加等）。 将200 μL的无菌和预加热的2%葡萄糖溶液分皮注射到鼻泡中，以支持其新陈代谢和补液。注：要制备无菌的2%葡萄糖溶液，在50 mL PBS中溶解1mg葡萄糖，并使用0.2 μm过滤器过滤。溶液可储存在4°C。 把动物送回笼子里 4.马拉塞齐亚引起的皮肤炎症分析 注：此程序描述了感染期间马拉塞齐亚引起的耳肿胀的分析，作为皮肤炎症的参数。分析真菌引起的耳肿胀的先决条件是在剥带和/或感染之前测量基线耳部厚度（步骤 3.5）。 准备异曲兰室，用于马拉塞齐亚感染和控制动物的短期麻醉。 一次将一只动物转移到房间，等待动物被完全麻醉。注：正确麻醉的迹象包括完全的身体放松以及缓慢和沉重的（侧）呼吸。仔细观察麻醉，因为长时间暴露在电胶中可能是致命的。 将动物从室内取出，并将其放在纸巾上。 使用卡钳（范围 0 – 5 mm）测量耳朵的厚度。测量每个耳朵的两个不同区域，并计算每只耳朵的平均厚度（参见步骤 3.5）。 把动物送回笼子。注：异脱麻醉寿命很短，动物从异苯二代室取出后30秒内恢复。 计算耳朵厚度的增加，从感染后每个时间点测量的平均耳厚中减去在剥离胶带和/或感染之前测量的平均基线耳厚。 将计算值绘制为耳厚增加，或者绘制为每个动物或动物组随时间而增加的总耳厚（图 2B）。 5. 受感染皮肤真菌负担分析 为每个耳朵制备无菌 2 mL 微离心管，在 dH2O 中含有 0.5 mL 的无菌 0.05% NP40 和一个灭菌钢球（直径 5 mm）。 使用精密平衡称量管，并记下精确重量。 通过CO2窒息使小鼠安乐死。 如步骤 5.1 – 5.2 所述，取下底座上的耳，并转移到含有 0.5 mL 无菌0.05% NP40 的管中。 称量包含耳组织的管子，并通过从管与器官的重量中减去没有器官的管的重量来计算每个样本的实际重量。 使用组织均质器在 25 Hz 下使耳组织均匀化 6 分钟。确保组织良好均质化。 将每个样品的100 μL板（对应每个均质的1/5，稀释系数= 5）放在mDixon琼脂板上，在30°C培养箱中倒置孵育板。注：应根据预期的真菌负荷调整同质化量。确保板充分均质，以获得至少10和不超过250个菌落每板，以便轻松枚举。可选择，每个样品的板板具有不同的均匀性稀释。 定期检查马拉塞齐亚殖民地的生长情况。注：菌落通常在2-3天后变得可见。马拉塞齐亚殖民地生长的时间取决于马拉塞齐亚的物种和菌株。 计算每盘的菌落。 使用以下公式计算 CFU/g 组织的数量：CFU/g 组织 = （菌落/板数） x （稀释因子） / （皮肤样本重量（g）。注： 可以使用以下公式评估近似最小检测限值：最小检测限值 = （1 孔/板） x （稀释因子） / （所有皮肤样本的平均重量（以 g 表示）。 真菌载荷通常绘制在对数尺度上（图2C）。