Denne rapport fremhæver kronologiske krav til ekstracellulær vesikelisode (EV) fra mikroglia eller blodmakrofager. Mikroglia-afledte elbiler blev evalueret som regulatorer af neurite udvækst, mens blod makrofag-afledte elbiler blev undersøgt i kontrol af C6 gliom celle invasion i in vitro assays. Målet er bedre at forstå disse EV funktioner som immun mæglere i specifikke mikromiljøer.
Den neuroinflammatoriske tilstand af centralnervesystemet (CNS) spiller en central rolle i fysiologiske og patologiske tilstand. Microglia, de hjemmehørende immunceller i hjernen, og nogle gange infiltrerende knoglemarv-afledte makrofager (BMDMs), regulere den inflammatoriske profil af deres mikromiljø i CNS. Det er nu accepteret, at den ekstracellulære vesikel (EV) populationer fra immunceller fungerer som immun mæglere. Deres indsamling og isolation er således vigtige for at identificere deres indhold, men også vurdere deres biologiske virkninger på recipientceller. De nuværende data fremhæver kronologiske krav til EV-isolering fra mikrogliaceller eller blodmakrofager, herunder trinnene ultracentrifugering og størrelsesundfadelseskromatografi (SEC). En ikke-målrettet proteomisk analyse gjorde det muligt at validere proteinsignaturer som EV-markører og karakteriserede det biologisk aktive EV-indhold. Mikroglia-afledte eldrevne køretøjer blev også funktionelt brugt på primær kultur af neuroner til at vurdere deres betydning som immun mæglere i neurite udvækst. Resultaterne viste, at mikroglia-afledte elbiler bidrager til at lette neurite udvækst in vitro. Sideløbende, blod makrofag-afledte elbiler blev funktionelt brugt som immun mæglere i sfæroide kulturer af C6 gliom celler, resultaterne viser, at disse eldrevne kontrol gliom celle invasion in vitro. Denne rapport fremhæver muligheden for at evaluere de EV-medieret immuncellefunktioner, men også forstå de molekylære baser for en sådan kommunikation. Denne dechifrering kunne fremme brugen af naturlige vesikler og/ eller in vitro forberedelse af terapeutiske vesikler med henblik på at efterligne immunegenskaber i mikromiljø af CNS patologier.
Mange neuropatologier er relateret til neuro-inflammatorisk tilstand, som er en kompleks mekanisme, der i stigende grad betragtes, men stadig dårligt forstået, fordi immunprocesser er forskellige og afhænger af cellemiljøet. CNS-lidelserne involverer ikke systematisk de samme aktiveringssignaler og immuncellepopulationer, og derfor er de pro- eller antiinflammatoriske reaktioner vanskelige at vurdere som årsager eller konsekvenser af patologier. Hjernen hjemmehørende makrofager kaldet “microglia” synes at være på grænsefladen mellem nerve og immunforsvar1. Microglia har en myeloid oprindelse og er afledt af blommesækken under primitive hæmatopoiese at kolonisere hjernen, mens perifere makrofager er afledt af fosterleveren under endelige hæmatopoiese at blive periferemakrofager 2. Mikrogliacellerne kommunikerer med neuroner og neuron-afledte gliaceller såsom astrocytter og oligodendrocytter3. Flere nylige undersøgelser har vist, at mikroglia er involveret i neuronal plasticitet under CNS udvikling og voksne væv homøostase, og også i den inflammatoriske tilstand forbundet med neurodegenerative sygdomme4,5. Ellers, integriteten af blod-hjerne barrieren kan blive kompromitteret i andre CNS patologier. Immunresponset, især i glioblastoma multiforme kræft, understøttes ikke kun af mikroglia celler som blod-hjerne barrieren er reorganiseret gennem angiogene processer og tilstedeværelsen af lymfekar6,7. Derfor, en stor knoglemarvs-afledte makrofager (BMDMs) infiltration forekommer i hjernen tumor hele tumor-afhængige angiogenese mekanismer8. Kræftcellerne udøver en betydelig indflydelse på infiltrerede BMDM’er, der fører til immunsuppressive egenskaber og tumorvækst9. Kommunikationen mellem immuncellerne og deres mikromiljø i hjernen er således vanskelig at forstå , da celleoprindelsen og aktiveringssignalerne er forskellige10,11. Det er derfor interessant at pågribe funktionerne i immuncelle-associerede molekylære signaturer i fysiologiske tilstande. I denne forbindelse kan cellecellekommunikationen mellem immunceller og cellemikromiljø undersøges ved frigivelse af ekstracellulære vesikler.
Eldrevne køretøjer er ved at blive undersøgt mere og mere i reguleringen af immunfunktioner i sunde såvel som patologiske tilstande12,13. Der kan tages hensyn til to populationer, exosomer og mikrobønsikler. De præsenterer forskellige biogenese og størrelse intervaller. Exosomer er vesikler af ~30-150 nm diameter og genereres fra endosomalsystemet og udskilles under fusion af flervesiulære kroppe (MVBs) med plasmamembranen. Mikroblærerne er ca. 100-1.000 nm i diameter og genereres ved en udadgående spirende fra celleplasmamembranen14. Da forskelsbehandlingen af exosom versus mikrovesicle stadig er vanskelig at realisere i henhold til størrelse og molekylære mønstre, vil vi kun bruge udtrykket eldrevne køretøjer i denne rapport. Den EV-associerede kommunikation i CNS er en forfædresmekanisme,da undersøgelser viste, at de er involveret i hvirvelløse arter, herunder nematoder, insekter eller annelids15,16. Desuden viser resultaterne, der viser, at eldrevne køretøjer kan kommunikere med celler fra forskellige arter, at denne mekanisme er et nøglelåsesystem, der først er baseret på genkendelse af overflademolekyler mellem vesikler og recipientceller og derefter gør det muligt at tage mediatorer16,17. Eldrevne køretøjer indeholder mange molekyler som proteiner (f.eks. enzymer, signaltransduktion, biogenesefaktor), lipider (f.eks. ceramid, kolesterol) eller nukleinsyrer (f.eks. DNA, mRNA eller miRNAs), der fungerer som direkte eller indirekte regulatorer af modtagercelleaktiviteterne14. Derfor blev der også udført metodologiske undersøgelser af immunceller for at isolere eldrevne køretøjer og fuldt ud karakterisere deres proteinsignaturer18,19.
De tidligste undersøgelser viste frigivelsen af exosomer fra primær dyrket rottemikroglia som en inducerende mekanisme efter en Wnt3a- eller serotonin-afhængig aktivering20,21. Funktionelt i CNS, microglia-afledte elbiler regulere synaptiske vesikel frigivelse af præsynaptiske terminaler i neuroner bidrager til kontrol af neuronal ophidselse22,23. Mikroglia-afledte eldrevne køretøjer kan også udbrede cytokiner-medieret inflammatorisk respons i store hjerneregioner24,25. Vigtigere er det, de forskellige ligander for vejafgift-lignende receptor familie kan aktivere specifikke produktioner af elbiler i microglia26. For eksempel viser in vitro-undersøgelser, at LPS-aktiverede mikroglia BV2-cellelinjer producerer differentiale ev-indhold, herunder proinflammatoriske cytokiner27. Derfor kan den funktionelle mangfoldighed af immuncelledepopulationer i CNS, mikroglia og infiltrerende BMDM’er evalueres gennem deres egne EV-populationer, herunder ev-indvirkningen på recipientceller og identifikation af ev-indhold.
Vi har tidligere beskrevet metoder til at evaluere de funktionelle egenskaber af mikroglia- og BMDM-afledte elbiler efter deres isolation16,19. I denne rapport foreslår vi uafhængigt at evaluere virkningen af mikroglia-afledte eldrevne energileverandører på neuriteudvækst og virkningen af makrofagebaserede eldrevne på kontrollen af gliomcelleaggregater. Denne undersøgelse foreslår også en bred proteomisk analyse af EV-fraktionerne med henblik på at validere EV-isolationsproceduren samt identificere de biologisk aktive proteinsignaturer. De gavnlige virkninger og den molekylære dechifrering af EV indhold kunne hjælpe deres mulige manipulation og brug som terapeutiske midler i hjernesygdomme.
Centralnervesystemet (CNS) er et komplekst væv, hvor celle-til-celle kommunikation regulerer normale neuronale funktioner, der er nødvendige for homøostase30. Eldrevne køretøjer er nu meget undersøgt og beskrevet som vigtige molekylære laster til celle-til-celle kommunikation31. De leverer specifikt en cocktail af mæglere til modtagerceller og påvirker dermed deres funktioner under sunde og patologiske forhold32. Nylige undersøgelser tyder …
The authors have nothing to disclose.
Det præsenterede værk blev støttet af Ministère de L’Education Nationale, de L’Enseignement Supérieur et de la Recherche og INSERM. Vi anerkender taknemmeligt BICeL- Campus Scientific City Facility for adgang til instrumenter og teknisk rådgivning. Vi anerkender taknemmeligt Jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard og Isabelle Fournier for massespektrometri bistand. Vi anerkender tanina arabere, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli og Pierre-Eric Sautière for deres stærke bidrag til den videnskabelige og tekniske udvikling.
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-rad | 4561045EDU | |
Acetonitrile | Fisher Chemicals | A955-1 | |
Amicon 50 kDa centrifugal filter | Merck | UFC505024 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) | Santa-cruz | sc-13119 | |
B27 Plus supplement | Gibco | A3582801 | |
BenchMixer V2 Vortex Mixer | Benchmark Scientific | BV1003 | |
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) | Bio-Rad | 5000006 | |
C18 ZipTips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
C6 rat glioma cell | ATCC | ATCC CCL-107 | |
Canonical tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804000010 | |
CO2 Incubator | ThermoFisher | ||
Confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | LSM880 | |
Cover glass | Marienfeld | 111580 | |
Culture Dish (60 mm) | Sarstedt | 82.1473 | |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
DMEM | Gibco | 41966029 | |
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | ThermoFisher | ||
Electron microscope JEM-2100 | JEOL | ||
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03777-10G | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
Exo-FBS | Ozyme | EXO-FBS-50A-1 | Exosome depleted FBS |
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs) | http://www.exocarta.org/ | ||
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140071 | |
Fetal Horse Serum | Biowest | S0960-500 | |
Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe | Fisherbrand | 12893543 | |
FlexAnalysis | Brucker | ||
Fluorescence mounting medium | Agilent | S3023 | |
Formic Acid | Sigma-Aldrich | 695076 | |
Formvar-carbon coated copper grids | Agar scientific Ltd | AGS162-3 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 340855 | |
Hoechst 33342 | Euromedex | 17535-AAT | |
Idoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
InstantBlue Coomassie Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
Invert light microscope CKX53 | Olympus | ||
L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
LabTek II 8 wells | Nunc | 154534 | |
Laemmli 2X | Bio-Rad | 1610737 | |
Laminin | Corning | 354232 | |
MaxQuant software (proteins identification software) | https://maxquant.net/maxquant/ | ||
MBT Polish stell | Brucker | 8268711 | |
MEM 10X | Gibco | 21090-022 | |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M6385-100G | |
MiliQ water | Merck Millipore | ||
Milk | Regilait | REGILAIT300 | |
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | |
MonoP FPLC column | GE Healthcare | no longer available | |
Nanosight NS300 | Malvern Panalytical | NS300 | |
NanoSight NTA software v3.2 | Malvern Panalytical | ||
NanoSight syringe pump | Malvern Panalytical | ||
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
Nonidet P-40 | Fluka | 56741 | |
Nunc multidish 24 wells | ThermoFisher | 82.1473 | |
Paraformaldehyde | Electro microscopy Science | 15713 | |
PC-12 cell line | ATCC | ATCC CRL-1721 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Peptide calibration mix | LaserBio Labs | C101 | |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
Perseus software (Processing of identified proteins) | https://maxquant.net/perseus/ | ||
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate | Santa-cruz | sc-362065 | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 78830 | |
Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190094 | no calcium, no magnesium |
pluriStrainer M/ 60 µm | pluriSelect | 43-50060 | |
Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | 355651 | |
Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich | S8830-20TAB | |
PureCol | Cell Systems | 5005 | |
Q-Exactive mass spectrometer | ThermoFisher | ||
rapifleX mass spectrometer | Brucker | ||
Rat cortical neurons | Cell Applications | R882N-20 | Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains |
Rat Macrophage & Microglia Culture Medium | Cell Applications | R620K-100 | Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow |
Rat primary macrophages | Cell Applications | R8818-10a | |
Rat primary microglia | Lonza | RG535 | |
Sepharose CL-2B | GE Healthcare | 17014001 | |
Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
Slide | Dustsher | 100204 | |
Sodium Chloride | Scharlau | SO0227 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | S7920-100G | |
Sodium hydroxide | Scharlab | SO0420005P | |
Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | S6422-100G | |
SpeedVac Vacuum Concentrator | ThermoFisher | ||
String software (functional protein association networks) | https://string-db.org/ | ||
SuperSignal West Dura extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | |
Syringe 1.0 mL | Terumo | 8SS01H1 | |
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
Tris | Interchim | UP031657 | |
Tris-Glycine | Euromedex | EU0550 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95765 | |
Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti | Beckman Coulter | 342184 | |
Uranyl acetate | Agar Scientific Ltd | AGR1260A | |
Whatman filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10347510 | |
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | C2020-25G |