Hemogene herprogrammering van menselijke fibroblasten door afgedwongen expressie van transcriptiefactoren

Dit protocol is uitgevoerd volgens de richtlijnen van het Comité ethiek van de Universiteit van Lund en moet worden uitgevoerd in overeenstemming met de individuele institutionele richtlijnen. 1. bereiding van het reagens Voor dulbecco’s gemodificeerde eagle’s medium (DMEM)/20% foetaal runderserum (FBS), meng hoge glucose-DMEM met natrium pyruvaat met 20% FBS, 1% penicillaire-streptomycine (pen/STREP), 1% L-glutamine, 1% niet-essentiële aminozuren en 10-4-M 2- mercapto ethanol. Meng voor volledige DMEM hoge glucose-DMEM met natrium pyruvaat met 10% FBS, 1% pen/STREP en 1% L-glutamine. Voor hematopoietische medium, meng hematopoietische medium (tabel van de materialen) met 10-6 M hydrocortison en 1% pen/STREP. Gebruik fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder calcium of magnesium. 2. menselijke huid fibroblast-isolatie Opmerking: HDFs kan worden aangeschaft bij gecertificeerde leveranciers (tabel met materialen). In dat geval, uit te breiden fibroblasten en gebruik ze direct in herprogrammering experimenten (sectie 4). Als alternatief kunnen Hdf’s worden geïsoleerd van donoren. Als fibroblasten geïsoleerd zijn van verschillende donoren, houd dan de monsters van elkaar gescheiden in alle stappen van het protocol. Etiket platen/putten en opvang buizen met het identificatienummer van elke donor. Verkrijg hdfs van 3 mm ronde huid Punch biopsieën uitgevoerd door gekwalificeerde artsen. Coat drie putjes van een weefsel cultuurbehandeld 6-Wells plaat met 500 μL 0,1% gelatine en inincuberen gedurende 20 min bij 37 °C. Aspireren de resterende gelatine oplossing en voeg 750 μL DMEM/20% FBS aan elk goed. Het gehele oppervlak van de put moet worden bedekt met medium. Voeg 1,5 mL DMEM/20% FBS toe aan het binnenoppervlak van een steriel 100 mm Petri schaaldeksel en verdeel de druppel met behulp van een serologische Pipet van 5 mL. Plaats de huid biopsie in het medium op het deksel met gesteriliseerde Tang. Ontleden de huid biopsie in negen identieke delen, met behulp van één gesteriliseerde scalpel om de biopsie op zijn plaats te houden en een tweede scalpel om te snijden. Plaats drie biopsie stukken per put met puntige Tang. Zorg ervoor dat de stukken aan de onderkant van de put hechten. Leg een 22 mm dekslip bovenop de stukken en breng enige druk aan. Incuberen de plaat bij 37 °C, 5% CO2, voor een week. Controleer de cellen dagelijks en voeg elke 2 dagen 200 μL DMEM/20% FBS toe om het verdampte medium te vervangen. Voeg na één week maximaal 2 mL DMEM/20% FBS toe en vervang medium elke 2 − 3 dagen. Passage cellen bij 1:4 ratio wanneer putten zijn Confluent Health (over 4 − 8 weken). Bereiden van 0,1% gelatine gecoate weefselcultuur-behandeld 6-well platen. Aspirate medium uit Wells bij 80% confluentie en was één keer met 1 ml PBS. Verwijder het afdekplaatje met steriele Tang en plaats de afdekplaat in een nieuwe put van een 6-put, met de weefsel zijde naar boven.Opmerking: Cellen die bleven gehecht aan de dekslip zullen ook worden geoogst. Voeg 500 μL dissociatie oplossing (tabel met materialen) per putje (met inbegrip van putten met de dekstroken) toe en inbroed bij 37 °c, 5% Co2 voor 5 − 10 min. Controleer wanneer cellen beginnen te stijgen vanaf de bodem van de put en deactiveer de dissociatie oplossing door toevoeging van 500 μL DMEM/20% FBS aan elk goed. Verzamel fibroblasten uit alle putjes in een conische buis van 15 mL. Voeg extra medium toe aan de putten om de resterende cellen te verzamelen. Centrifugeer de buis bij 350 x g gedurende 5 minuten. Voeg intussen 500 μL DMEM/20% FBS toe aan elke put van eerder gelatine gecoate platen. Aspirate medium en respenderen fibroblasten in 6 mL DMEM/20% FBS. Voeg 500 μL fibroblast-suspensie toe aan elke put (twee 6-put-platen per monster/donor in totaal). Incuberen cellen ‘s nachts bij 37 °C, 5% CO2. Voeg op de volgende dag 1 mL DMEM/20% FBS toe aan elk goed. Vervang medium met 2 mL DMEM/20% FBS elke 2 − 3 dagen totdat Wells 80% Confluent zijn. Herhaal sectie 2,11 voor drie confluente putten totdat de derde passage is bereikt. Vries fibroblasten uit de confluente putten (passages 1 en 3). Aspirate medium uit de putjes en was één keer met 1 mL PBS. Dissociëren en het verzamelen van fibroblasten zoals beschreven in de stappen 2.11.4 en 2.11.5. Tel cellen met een hemocytometer en centrifugeer de buis bij 350 x g gedurende 5 minuten. Na centrifugeren, aspiraat medium en respenderen fibroblasten in FBS met 10% DMSO bij een dichtheid van 5 x 105 cellen/ml. Voeg 1 mL celsuspensie per cryovial toe en vriescellen ‘s nachts bij-80 °C met behulp van een Vries container. Verplaats flesjes naar-150 °C (vloeibare stikstof) voor langdurige opslag. 3. linvirale productie Kweek HEK293T cellen in een weefsel cultuurbehandelde schaal van 100 mm met 10 mL complete DMEM, bij 37 °C, 5% CO2, totdat de confluentie is bereikt. Op de dag voorafgaand aan de transfectie, aspiraat medium en was het gerecht zorgvuldig met 5 ml PBS. Voeg na het verwijderen van PBS 1,5 mL dissociatie oplossing toe en inbroed bij 37 °C, 5% CO2 voor 5 − 10 min om cellen uit de schaal te ontkoppelen.Opmerking: Het wordt aanbevolen om zowel PBS als dissociatie oplossing te verwarmen voordat u ze gebruikt, zodat cellen geen thermische schok ondervinden. Inactiveer dissociatie oplossing met 3 mL complete DMEM en breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 mL. Was de schaal met 5 mL complete DMEM om overgebleven bijgevoegde cellen te verwijderen en breng dit volume over naar de 15 mL conische buis. Centrifuge celsuspensie bij 350 x g gedurende 5 min. Aspirate supernatant en Splits de celpellet gelijkmatig tussen 6 100 mm weefsel cultuurbehandelde gerechten in een eindvolume van 10 mL volledige DMEM per gerecht. Cellen moeten ongeveer 60% Confluent Health zijn tegen de tijd van transfectie. Op de volgende dag worden cellen met het plasmide mixen als volgt:Opmerking: dit deel van het protocol beschrijft de productie van lentivirussen in 1 100 mm weefsel cultuurbehandeld gerecht per plasmide mix. Om hogere volumes linviraal supernatant te verkrijgen voor concentratie, gebruik ten minste 4 100 mm HEK293T celkweek gerechten per mix. Voeg in een conische buis van 15 mL 10 μg van de drie transferplasmiden samen: 3,33 μg pFUW-tetO-GATA2 (Addgene plasmide #125028)14, 3,33 μg Pfuw-TETO-GFI1B (addgene #125597)14 en 3,33 μg Pfuw-Teto-FOS (addgene #125598)14, plus 10 μg van de 2ND generatie psPAX2 verpakking vector coderen de gag, Pol, Tat en rev genen (addgene #12260) en 5 μg PMD2. G envelop vector codering van het VSV-G- gen (addgene #12259). Voeg water toe tot 500 μL. Voeg in twee nieuwe conische buizen van 15 mL 10 μg FUW-M2rtTA plasmide (Addgene #20342)17, 10 μg psPAX2 verpakkings vector en 5 μg PMD2. G envelop vector toe aan elke buis. Voeg water toe tot 500 μL. Een buis zal worden gebruikt als een controle. Voeg aan elke buis 62,5 μL van 2 M CaCl2toe. Laat vervolgens de bubbels in elk mengsel los met behulp van een Pasteur-pipet dat in een pipet controller wordt gestoken. Pipetteer, terwijl er bellen worden gevormd, 500 μL van n, n-bis(2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfoninezuur (BES) gebufferde zoutoplossing (pH 7,1, 25 °c), met een P1000 Pipet, druppel-Wise tegen het Pasteur-pipet en op het mengsel. Inbroed buisjes gedurende ten minste 15 minuten bij kamertemperatuur. De mengsels zullen na enige tijd licht bewolkt lijken. Ondertussen, aspiraat medium uit HEK293T celgerechten (doorgangen de dag voordien) en voeg 10 ml volledige DMEM zonder antibiotica. Wees voorzichtig en voeg gemiddeld langzaam toe omdat HEK293T cellen semi-aanhandig zijn. Verdeel elk afzonderlijk mengsel (ongeveer 1 mL) gelijkmatig en drop-wise in afzonderlijke gerechten en inincuberen ‘s nachts bij 37 °C, 5% CO2. Vervang medium door 4 mL complete DMEM, 24 uur na incubatie. Incubate ‘s nachts bij 37 °C, 5% CO2. Indien beschikbaar, inincuberen in plaats van 32 °C, 5% CO2, omdat de gereduceerde temperatuur de halfwaardetijd van de linvirale deeltjes zal verhogen. Verzamel supernatant met linvirale deeltjes drie keer tot een conische buis van 50 mL. Meng op dit moment niet verschillende linvirale deeltjes. Elk gerecht zal resulteren in 12 mL linviraal supernatant. Vier gerechten van dezelfde virale voorbereiding passen in 1 50 mL conische buis.Let op: het uitvoeren van lentivirale inzameling in een bioveiligheid niveau-2 laboratorium in een laminaire stroom afzuigkap gewijd aan linviraal werk en plaats virus verontreinigd afval (tubes, tips, gerechten) in een geschikte container voor biogevaarlijke materialen. Doe de eerste collectie 16 h na de laatste incubatie en voeg 4 mL complete DMEM toe. Incuberen bij 37 °C, 5% CO2. Doe de tweede verzameling 8 h na de eerste tot dezelfde buis, Voeg 4 mL complete DMEM toe en inincuberen bij 37 °C, 5% CO2. Doe de derde collectie 16 h na de tweede naar dezelfde buis en gooi de gerechten weg.Opmerking: Bewaar linviraal supernatanten na elke verzameling bij 4 °c. Filtreer elke linvirale supernatant met behulp van een laag-proteïne binding filter van 0,45 μm met een cellulose acetaat membraan (tafel van de materialen) op een schone buis. Voeg maximaal 15 mL gefilterde supernatant toe aan een centrifugale filtereenheid met een geregenereerd cellulose membraan (tabel met materialen) en spin bij 4.000 x g gedurende 25 minuten bij 4 °c. Doorstroom verwijderen. Een visceuze vloeistof met lentivirussen zal in de filter unit blijven. Herhaal stap 3,13 door 15 mL supernatant bovenop de filtereenheid toe te voegen, totdat er geen lentivirale supernatant meer overblijft.Opmerking: Wanneer er slechts een paar milliliter van supernatant te concentreren, de spin tijd te verlagen tot 10 min. Als er nog steeds extra vloeistof (niet-visceus) op het filter zit, centrifugeer dan nog 10 min. Maak aliquots (50 − 200 μL afhankelijk van het initiële supernatans volume) van elk type geconcentreerd linvirussen en bewaar bij-80 °C voor langdurige opslag (1 − 2 jaar) of bij 4 °C voor kortdurende opslag (1 − 2 weken).Opmerking: Geconcentreerde of niet-geconcentreerde linvirussen kunnen ook vers worden gebruikt. Niet opnieuw bevriezen en ontdooien omdat dit resulteert in een gereduceerde titer. 4. hemogene herprogrammering Opmerking: Gebruik HDFs met een passage nummer van drie (P3) of hoger (tot P10) om opnieuw te programmeren experimenten uit te voeren. Mantel een 100 mm weefsel cultuurbehandeld gerecht met 5 mL 0,1% gelatine en inincuberen bij 37 °C gedurende 20 min. aspireren de resterende gelatine oplossing. Ontdooien een fibroblast-injectieflacon en plaat cellen in de 0,1% gelatine gecoate schaal. Incubate ‘s nachts bij 37 °C, 5% CO2. Indien nodig, uit te breiden fibroblasten voor een langere periode van tijd totdat de gewenste passage en confluentie zijn bereikt. Mantel een 6-goed weefselcultuur behandelde plaat met 500 μL van 0,1% gelatine oplossing en inincuberen bij 37 °C gedurende 20 min. Verwijder extra gelatine. Plaat HDFs met een dichtheid van 150.000 cellen per plaat (25.000 cellen per put) in 2 mL van volledige DMEM per put. Incuberen ‘s nachts bij 37 °C, 5% CO2, om celbevestiging toe te staan. Vervang medium door 2 mL complete DMEM plus 8 μg/mL polybrene. Bereid een 1:1 ratio mix van in het zwembad geproduceerde TF lentivirussen en M2rtTA in een nieuwe microcentrifuge buis.Opmerking: In dit protocol, pool-productie van lentivirussen voor de drie TFs wordt uitgevoerd, die, in de handen van de auteurs, resulteert in een hogere herprogrammering efficiëntie. Als alternatief wordt voorgesteld om een titratie van de afzonderlijke linvirale deeltjes door qPCR18uit te voeren op een standaard cellijn. Dit zal worden gebruikt voor het definiëren van het volume van de afzonderlijke virussen die nodig zijn om te voldoen aan een veelheid van infectie (MOI) optimaal voor co-transductie en hemogene herprogrammering. Verdeel 10 tot 100 μL linviraal mengsel per put, om hdfs te bezorgd. Dit is dag-2 van herprogrammering.Opmerking: Het bepalen van het optimale volume van lentivirale mix voor efficiënte herprogrammering, zonder afbreuk te doen aan de levensvatbaarheid van de cel, vereist optimalisatie (Zie aanvullende figuur 1 voor meer details). Hdf’s met meer dan 7 passages kunnen hogere volumes van virussen vereisen dan cellen met lagere passages. Verwijder na 16 uur incubatie virussen en voeg complete DMEM toe. Laat cellen herstellen voor 6 − 8 uur. Na herstel, aspiraat medium en voeg 2 ml volledige DMEM met 8 μg/ml polybrene. Doe een tweede transductie zoals beschreven in stap 4,6 en incuberen bij 37 °C, 5% CO2 voor 16 uur. Dit is dag-1 van herprogrammering. De linvirale mix kan op dag 2 worden bereid voor beide transducties en bewaard bij 4 °C. De volgende dag, verwijder de virussen en voeg complete DMEM aangevuld met 1 μg/mL DOX. Dit is dag 0 van herprogrammering. Incuberen bij 37 °C, 5% CO2 voor 48 h. Op dag 2 van herprogrammering, splitsen elk goed bij 1:2 ratio. Aspirate medium en Wash cellen met 1 mL PBS. Laat PBS en dissociëren cellen met 500 μL dissociatie oplossing. Incuberen 5 − 10 min bij 37 °C, 5% CO2. Inactiveer de dissociatie oplossing met 1 mL complete DMEM en verzamel cellen in een conische buis. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 min. Resubreng de pellet in hematopoietische medium (zie stap 1,3), aangevuld met 1 μg/mL DOX, en plaat cellen in nieuwe weefselcultuur behandeld 6-well platen gecoat met 0,1% gelatine tot een eindvolume van 2 mL per put. Verander medium (hematopoietische medium plus DOX) tweemaal per week voor de duur van de herprogrammeer culturen (25 dagen). Analyseer resulterende geherprogrammeerde cellen op verschillende tijdstippen door brightfield of fluorescentiemicroscopie (Zie aanvullende figuur 2), Flowcytometrie, bulk-en eencellige RNA-sequencing, en transplantatie-assays voor de verwerving van hematopoietische morfologie, aanwezigheid van endotheliale en hematopoietische markers, overname van endotheliale/hematopoietische genexpressie profiel en regeneratiecapaciteit14. 5. optimalisatie van fibroblast-expansie voor ChIP-SEQ-analyse bij het begin van Hemogene herprogrammering Plaat 300.000 HDFs (< P8) in 0,1% gelatine gecoate weefselcultuur-behandelde 6-well platen met volledige DMEM tot een laatste volume van 2 mL per put. Incubate 's nachts bij 37 °C, 5% CO2. Op de volgende dag, vervang medium met volledige DMEM aangevuld met 8 μg/mL polybrene. Cellen met individuele factoren: pFUW-tetO-FOS14, PLV-TETO-ha-GFI1B (addgene #125599)14 en pfuw-Teto-3xflag-GATA2 (addgene #125600)14 of met een pool van de drie factoren, plus fuw-M2rtTA bij 1:1 ratio. Gebruik 10 − 20 μL totaal virus (individuele TF + M2rtTA of drie TFs + M2rtTA). Incuberen cellen ‘s nachts bij 37 °C, 5% CO2.Opmerking: Het wordt aanbevolen om te gebruiken twaalf 6-goed platen per staat (voor elke individuele TF en de drie TFs gecombineerd). Verwijder linvirussen en voeg complete DMEM 16 h toe na de eerste transductie. Laat de cellen herstellen voor 6 − 8 uur. Cellen een tweede keer met dezelfde hoeveelheid virus per aandoening en incuberen bij 37 °C, 5% CO2. Op de volgende dag verwijderen virussen en voeg complete DMEM. Incuberen bij 37 °C, 5% CO2 voor 24 uur. Re-Plate elk goed in een 0,1% gelatine gecoate weefselcultuur behandeld 100 mm schotel met volledige DMEM tot een eindvolume van 10 mL per schotel. Dit vertegenwoordigt ongeveer een 1:6 passage. Laat cellen groeien voor 6 dagen bij 37 °C, 5% CO2. Op dag 6 na re-plating, aspiraat medium en voeg volledige DMEM met 1 μg/ml Dox. Incuberen cellen bij 37 °C, 5% CO2 voor 2 dagen. Verzamel fibroblasten en analyseer genomische bindingsplaatsen van de drie TFs getransduceerde afzonderlijk of in combinatie, door ChIP-SEQ 2 dagen na DOX suppletie14.Opmerking: De laatste 72 100 mm-gerechten zullen tussen 20 − 50 x 106 cellen bevatten, voldoende om chip-SEQ-experimenten en-replicaten uit te voeren.