通过转录因子的强制表达，人类纤维细胞的造血再编程

该协议是根据隆德大学人类研究伦理委员会的指导方针执行的，应当按照个别机构准则执行。 1. 试剂制备 对于 Dulbecco 的改性 Eagle 介质 （DMEM）/20% 胎儿牛血清 （FBS），将含有丙酮酸钠的高葡萄糖 DMEM 与 20% FBS、1% 青霉素-链霉素 （笔/链球菌）、1% L-谷氨酰胺、1% 非必需氨基酸和 10-4-M 2-麦卡托乙醇。 对于完整的DMEM，将含有丙酮酸钠的高葡萄糖DMEM与10S、1%Pen/链环和1%L谷氨酰胺混合。 对于造血介质，将造血介质（材料表）与10-6M氢皮质酮和1%笔/链球菌混合。 使用磷酸盐缓冲盐水（PBS），不含钙或镁。 2. 人类皮肤纤维细胞隔离 注：HDF 可以从认证供应商处购买 （材料表）.在这种情况下，扩展成纤维细胞，并直接使用它们在重新编程实验中（第4节）。或者，HDF 可以从捐助者中分离出来。如果从不同的捐赠者中分离出来成纤维细胞，在协议的所有步骤中保持样品彼此分离。带有每个捐赠者的识别号的牌/孔和收集管。 从由合格医生进行的 3 mm 圆形皮肤冲孔活检中获得 HDF。 用500μL 0.1%明胶涂覆组织培养处理的6孔板的三口井，在37°C下孵育20分钟。 吸气剩余的明胶溶液，并在每口井中加入750μL的DMEM/20S。油井的整个表面应用介质覆盖。 将 1.5 mL 的 DMEM/20% FBS 添加到无菌 100 mm 培养皿盖的内表面，并在 5 mL 血清移液器的帮助下将跌落展开。 将皮肤活检置于用消毒钳子放在盖子上的介质中。 将皮肤活检分成九个相同的部分，使用一个消毒手术刀将活检放在原位，用第二个手术刀进行切割。 使用尖钳每井放置三个活检片。确保这些部件附着在井底。 在件上放置一个 22 mm 盖玻片，然后施加一些压力。 在37°C，5%CO2孵育板一周。每天检查细胞，每2天加入200μL的DMEM/20S，以取代蒸发的介质。 一周后，添加高达 2 mL 的 DMEM/20% FBS，每 2⁄3 天更换一次介质。 当井流时（约4~8周），通道细胞比例为1：4。 准备 0.1% 明胶涂层组织培养处理的 6 孔板。 在80%的汇合时从井中吸气培养基，用1mL的PBS洗涤一次。 用无菌钳子拆下盖玻片，并将盖玻片放入 6 孔板的新井中，组织侧向上。注：与盖玻片相连的细胞也将被收获。 每口井（包括带盖玻片的井）加入500μL解离溶液（材料表），在37°C下孵育，5%CO2孵育5-10分钟。在每个井中加入 500 μL 的 DMEM/20% FBS。 从所有井中收集成纤维细胞到15 mL锥形管中。向井中添加额外的介质以收集剩余的细胞。将管在 350 x g下离心 5 分钟。 同时，在以前的明胶涂层板的每个孔中加入 500 μL 的 DMEM/20% FBS。 在 DMEM/20% FBS 的 6 mL 中吸气介质和重新悬浮成纤维细胞。 在每个孔中加入500μL的成纤维细胞悬浮液（每个样品/供体共两个6孔板）。在37°C，5%CO2孵育细胞过夜。 第二天，在每个井中添加 1 mL 的 DMEM/20% FBS。每 2⁄3 天用 2 mL 的 DMEM/20% FBS 更换介质，直到油井 80% 汇出。 对三个汇出孔重复第 2.11 节，直到到达第三个通道。 从汇井中冻结成纤维细胞（通道 1 和 3）。 从井中吸气介质，用1mL的PBS清洗一次。 如步骤 2.11.4 和 2.11.5 所述分离和收集成纤维细胞。 用血细胞计对细胞进行计数，并在350 x g下将管离心5分钟。 离心后，在FBS中吸气培养基和重新悬浮成纤维细胞，在5 x 105细胞/mL的密度下，用10%DMSO。 每个冷冻室加入1mL的细胞悬浮液，并使用冷冻容器在-80°C冷冻细胞过夜。将小瓶移至-150°C（液氮），以便长期储存。 3. 伦蒂病毒生产 在100毫米组织培养处理的培养皿中生长HEK293T细胞，其完整DMEM为10mL，在37°C，CO2为5%，直到达到汇合。 在转染前一天，吸气介质，用5mL的PBS仔细洗碗。 去除PBS后，加入1.5 mL的解离溶液，在37°C下孵育，5%CO 2，5-10分钟，使细胞从培养皿中分离。注：建议在使用前加热PBS和解散溶液，使细胞不会遭受热冲击。 使用 3 mL 的完整 DMEM 灭活分离溶液，并将细胞悬浮液转移到 15 mL 锥形管中。用 5 mL 的完整 DMEM 清洗盘子，以去除剩余的附着细胞，并将此体积转移到 15 mL 锥形管中。 离心细胞悬浮在350 x g下5分钟。 吸气上清液，在六个100毫米组织培养处理的菜肴之间均匀地分粒细胞颗粒，最终体积为每盘10 mL的完整DMEM。到转染时，细胞应约60%的结对。 第二天，具有质粒混合物的转染细胞如下：注：该协议的这一部分描述了每个质粒混合物在一个100毫米组织培养处理盘中生产慢病毒。要获得更高体积的慢病毒上清液浓度，请每次混合至少使用四个 100 mm HEK293T 细胞培养皿。 在15 mL锥形管中，将三个转移质粒中的10微克加在一起：3.33微克的pFUW-tetO-GATA2（添加基因质粒#125028）14，3.33微克pFUW-tetO-GFI1B（添加基因#125597）14和3.33微克pFUW-tetO-FOS（添加基因#12559810 μg的第二代 psPAX2 封装载体编码Gag、Pol、Tat和Rev基因（添加基因#12260）和 5 μg pMD2.G 包络载体编码VSV-G基因（添加基因#12259）。 加水高达500μL。 在两个新的15 mL锥形管中，向每个管中加入10μg的FUW-M2rtTA质粒（添加基因#20342）17、10μg psPAX2包装载体和5μgpMD2.G包络载体。加水高达500μL。一根管子将用作控制。 每管添加62.5 μL的2MCaCl2.接下来，使用插入移液器控制器的巴斯德移液器将气泡释放到每个混合物中。当气泡形成时，移液器 500 μL N， N-bis（2-羟基） -2-氨基硫酸 （BES） 缓冲盐水 （pH 7.1， 25 °C）， 与 P1000 移液器， 滴对巴斯德移液器和混合物. 在室温下孵育管至少15分钟。混合物在一段时间后会出现轻微多云。 同时，从HEK293T细胞菜肴（前一天通过）的吸气介质，并在不带抗生素的情况下加入10mL的完整DMEM。小心，慢慢添加培养基，因为HEK293T细胞是半粘附的。 均匀地将每种混合物（约1 mL）均匀分布到单独的菜肴中，并在37°C、5%CO2下孵育过夜。 用4 mL的完整DMEM，孵育后24小时更换培养基。在37°C，5%CO2下孵育过夜。如果可用，在32°C，5%CO2孵育，因为温度降低将增加慢病毒颗粒的半寿命。 收集上清液与慢病毒颗粒三次到50 mL锥形管。此时不要混合不同的慢病毒颗粒。每道菜会产生12 mL的慢病毒上清液。四个相同病毒制剂的菜肴适合一个 50 mL 锥形管。注意：在用于慢病毒工作的层流罩中的生物安全-2级实验室中进行慢病毒收集，并将病毒污染废物（管、尖、碟）放入适当的容器中，用于生物有害物质。 在最后一次孵育后16小时进行第一次采集，并添加4 mL的完整DMEM。在37°C下孵育，CO2为5%。 做第二次收集8小时后，第一个到同一管，添加4 mL的完整DMEM和孵育在37°C，5%CO2。 做第三次收集16小时后，第二个到同一管，并丢弃的盘子。注：每次收集后，将慢病毒上生子储存在4°C。 使用0.45μm低蛋白结合过滤器过滤每个慢病毒上清液，用醋酸纤维素膜（材料表）过滤到干净的管中。 在具有再生纤维素膜（材料表）的离心滤芯单元中，向离心滤芯单元添加最多 15 mL 的过滤上清液，并在 4°C 下以 4，000 x g旋转 25 分钟。丢弃流通过。含有慢病毒的粘性液体将保留在过滤单元中。 通过在过滤单元顶部添加 15 mL 上清液来重复步骤 3.13，直到没有更多的慢病毒上清液。注：当只有几毫升的上清液浓缩时，将旋转时间缩短至10分钟。如果过滤器上仍有多余的液体（非粘性），则再离心 10 分钟。 使每种浓缩扁豆病毒的等分（50~200 μL，取决于初始上清体积）在-80°C储存，用于长期储存（1⁄2年）或4°C，用于短期储存（1⁄2周）。注：浓缩或非浓缩的慢病毒也可以新鲜使用。不要重新冻结和解冻，因为这将导致减少的丁二重。 4. 造血再编程 注：使用通道数为三 （P3） 或更高的 HDF（直到 P10）执行重新编程实验。 用5mL 0.1%明胶涂上100毫米组织培养处理的培养皿，在37°C孵育20分钟。 在 0.1% 明胶涂层盘中解冻成纤维细胞小瓶和板细胞。在37°C，5%CO2下孵育过夜。如有必要，将成纤维细胞扩大更长时间，直到达到所需的通道和汇合。 用500μL的0.1%明胶溶液涂覆6孔组织培养处理板，在37°C孵育20分钟。 每孔密度为 150，000 个单元（每孔 25，000 个单元）的板 HDF，每孔 2 mL 的 DMEM。在37°C，5%CO2孵育过夜，以允许细胞附着。 用 2 mL 的完整 DMEM 加上 8 μg/mL 多宝醇更换介质。在新的微离心管中制备池状TF慢病毒和M2rtTA的1：1比例组合。注：在此协议中，对三个 T 的慢病毒进行池生产，这在作者手中，可产生更高的重新编程效率。或者，建议在标准细胞系上用qPCR18对单个慢病毒颗粒进行滴定。这将用于定义单个病毒的体积，以满足多种感染 （MOI） 最佳共转导和造血再编程。 每口井分配10至100 μL的慢病毒混合物，以转导HDF。这是重新编程第 2 天。注：在不影响细胞活力的情况下，定义慢病毒混合物的最佳体积，以便进行有效的重新编程，这需要优化（有关更多详细信息，请参阅补充图 1）。与通道较低的细胞相比，通道超过 7 个通道的 HDF 可能需要更高的病毒量。 孵育16小时后，清除病毒并添加完整的DMEM。允许细胞恢复6~8小时。 恢复后，吸气介质，加入2 mL的完整DMEM与8μg/mL聚二苯乙烯。 如步骤 4.6 所述进行第二次转导，在 37°C 下孵育，CO2为 16 小时孵育。这是重新编程第 1 天。慢病毒混合物可在-2日为两种转导做好准备，并保持在4°C。 第二天，清除病毒，并添加完整的DMEM，辅以1μg/mL DOX。这是重新编程的 0 天。在37°C下孵育，5%CO2孵育48小时。 在重新编程第 2 天，以 1：2 的比例分割每个井。 吸气培养基和洗涤细胞与1 mL的PBS。 用500μL解毒溶液吸气PBS和分离细胞。在37°C下孵育5-10分钟，CO2为5%。 使用 1 mL 的完整 DMEM 灭活分离溶液，并将细胞收集到锥形管中。在 350 x g下离心 5 分钟。 在造血介质中重新悬浮颗粒（参见步骤 1.3），辅以 1 μg/mL DOX，并将板细胞放入经过新组织培养处理的 6 孔板中，涂有 0.1% 明胶，最终体积为每孔 2 mL。 在重新编程培养期间（25天），每周两次改变介质（造血介质加DOX）。 通过明场或荧光显微镜分析不同时间点产生的重新编程的细胞（参见补充图2）、流式细胞测定、散装和单细胞RNA测序以及用于采集的移植检测造血形态学，内皮和造血标记的存在，内皮/造血基因表达的获取和再生能力14。 5. 在造血再编程的发病时，ChIP-seq分析的纤维细胞扩展优化 板 300，000 HDF （<P8） 在 0.1% 明胶涂层组织培养处理 6 孔板与完整的 DMEM 到每孔 2 mL 的最终体积。在37°C，5%CO2下孵育过夜。 第二天，用完整的DMEM替换介质，辅以8微克/mL聚二苯乙烯。 转导具有单个因子的细胞：pFUW-tetO-FOS14、pLV-tetO-HA-GFI1B（#125599添加基因）14和pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2（添加基因#125600）14或具有三个因子的池，加上FUW-M2rtTA在1：1的比例。使用 10~20 μL 总病毒（单个 TF + M2rtTA 或三个 TF = M2rtTA）。在37°C，5%CO2孵育细胞过夜。注：建议每个条件使用 12 个 6 孔板（对于每个单独的 TF 和三个 TF 组合）。 去除慢病毒，并在第一次转导后添加完整的DMEM 16 h。让细胞恢复6~8小时。 以相同数量的病毒，在37°C，CO2中孵育细胞。 第二天删除病毒并添加完整的 DMEM。在37°C下孵育，5%CO2孵育24小时。 将每口孔重新盘入 0.1% 明胶涂层组织培养处理的 100 mm 盘中，并带有完整的 DMEM，最终体积为每盘 10 mL。这表示大约 1：6 的段落。 允许细胞在37°C，5%CO2下生长6天。 在重新电镀后第 6 天，吸气介质，并添加完整的 DMEM，带 1 μg/mL DOX。在37°C下孵育细胞，5%CO2，2天。 收集成纤维细胞和分析三个TF的基因组结合位点单独或组合，由ChIP-seq 2天后DOX补充14。注：最后72个100毫米的碟子将包含20×50×106个细胞，足以进行ChIP-seq实验和复制。