Tecniche di spettrometria ione Mobilità-Massa per determinare la struttura e i meccanismi del riconoscimento degli ioni metallici e dell'attività di redox degli oligopeptidi di metal linciazione

Gli ioni di rame e zinco sono essenziali per gli organismi viventi e cruciali per i processi tra cui la protezione ossidativa, la crescita dei tessuti, la respirazione, il colesterolo, il metabolismo del glucosio e la lettura del genoma¹. Per abilitare queste funzioni, gruppi come il tiolati di Cys, imidazole del Suo^2,3, (più raramente) thioether di methionina, e carboxylate di Glu e Asp incorporano selettivamente i metalli come cofattori nei siti attivi di enzimi in metallo. La somiglianza di questi gruppi di coordinamento solleva una domanda intrigante riguardo al modo in cui i ligandi Dei Suoi e dei Cys incorporano selettivamente cu(I/II) o n(II) per garantire il corretto funzionamento.

L’associazione selettiva è spesso realizzata mediante l’acquisizione e la tratta di peptidi, che controllano le concentrazioni di ioni di Cu(I/II)⁴. Cu(I/II) è altamente reattivo e causa danni ossidativi o legame avventuroso agli enzimi, quindi la sua concentrazione libera è strettamente regolata da chaperones in rame e proteine che regolano il rame che lo trasportano in modo sicuro in varie posizioni nella cellula e strettamente controllare la sua omeostasi^5,6. L’interruzione del metabolismo del rame o dell’omeostasi è direttamente implicata nella malattia di Menkes e Wilson⁷ così come i tumori⁷ e disturbi neurali, come il prione⁸ e il morbo di Alzheimer⁹.

La malattia di Wilson è associata all’aumento dei livelli di rame negli occhi, nel fegato e nelle sezioni del cervello, dove le reazioni di redox di Cu(I/II) producono specie reattive dell’ossigeno, causando degenerazione epatolenticola e neurologica. Le terapie di chelatazione esistenti sono la piccola penicillamina e trietilenetetramina. In alternativa, i peptidi metanoobatteri di rame metatonobatteri (mb)^10,11 presentano un potenziale terapeutico a causa della loro elevata affinità legante per Cu(I)¹². Quando il metanobatteritina (mb-OB3b) del metilosino trichosporium OB3b è stato studiato in un modello animale della malattia di Wilson, il rame è stato efficacemente rimosso dal fegato ed escreto attraverso la bile¹³. Gli esperimenti in vitro hanno confermato che mb-OB3b potrebbe masticare il rame dal metallothionein di rame contenuto nel citosol epatico¹³. Le tecniche di imaging della spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente hanno studiato la distribuzione spaziale del rame nei campioni epatici della malattia di Wilson^14,15,16 e hanno dimostrato che mb-OB3b rimuove il rame con brevi periodi di trattamento di soli 8 giorni¹⁷.

L’mb-OB3b si legherà anche con altri ioni metallici, tra cui Ag(I), Au(III), Pb(II), Mn(II), Co(II), Fe(II), Ni(II) e n(II)^18,19. Il concorso per il sito di rilegatura fisiologica Cu(I) è esposto da Ag(I) perché può spostando Cu(I) dal complesso mb-OB3b, con Ag(I) e Ni(II) che mostrano anche un legame irreversibile a Mb che non può essere spostato da Cu(I)¹⁹. Recentemente, una serie di oligopeptidi alternativi di metanobatterica (amb) con il motivo di rilegatura 2His-2Cys sono stati studiati^20,21, e le loro proprietà di rilegatura di N (II) e Cu(I/II) sono state studiate. Le loro sequenze di amminoacidi primarie sono simili, e contengono tutte il motivo 2His-2Cys, Pro e un N-terminus acetilato. Essi differiscono principalmente da mb-OB3b perché il motivo 2His-2Cys sostituisce i due siti di rilegatura enethiol oxazolone di mb-OB3b.

La ionizzazione dell’elettrospray accoppiata con la spettrometria di massa-massa a ioni (ESI-IM-MS) fornisce una potente tecnica strumentale per determinare le proprietà di legame dei metalli dei peptidi perché misura la loro massa a carica (m/z) e la collisione (CCS) conservando la massa, la carica e la forma conformazionale dalla fase della soluzione. I m/z e ccS si riferiscono alla stochichiometria dei peptidi, allo stato di protonazione e alla forma conformazionale. La stoichiometria è determinata perché l’identità e il numero di ogni elemento presente nella specie sono esplicitamente identificati. La carica complessiva del complesso di peptidi si riferisce allo stato di protonazione dei siti acidi e di base e allo stato di ossidazione degli ioni metallici. Il CCS fornisce informazioni sulla forma conformazionale del complesso di peptidi perché misura la dimensione media rotazionale che si riferisce alla struttura terziaria del complesso. Lo stato di carica generale del complesso è anche una funzione di pH e colpisce l’affinità di legame degli ioni metallici del peptide perché i siti di base deprotonizzati o acidi come il carboxyl, His, Cys e Tyr sono anche i potenziali siti di legame per gli ioni metallici. Per le analisi, il peptide e gli ioni metallici vengono preparati in soluzioni acquose con il pH regolato da acido acetico aluto o idrossido di ammonio. Ciò consente di determinare la dipendenza da pH e la selettività degli ioni metallici per il peptide. Inoltre, l’m/z e la CCS determinati da ESI-IM-MS possono essere utilizzati con la modellazione molecolare B3LYP/LanL2D per scoprire il tipo di coordinamento degli ioni metallici e la struttura terziaria del complesso. I risultati mostrati in questo articolo rivelano come ESI-IM-MS può caratterizzare le prestazioni di chelating selettivo di una serie di amb peptidi e confrontarli con il peptide mb-OB3b di legame di rame.