Una adaptación de semi-alto rendimiento del ensayo ATPase acoplado a NADH para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas

Las miosinas son transductores de energía mecanoquímicos que hidrolizan trifosfato de adenosina (ATP) para generar movimientodireccional a lo largo de los filamentos del citoesqueleto de actina en eucariotas 1,². Se han adaptado tanto estructural como cinéticamente a sus diversas funciones intracelulares, como el transporte deorgánulos, la contracción muscular o la generación de tensión citoesquelética 1,^2. La superfamilia de miosina está representada por genes de miosina de 40 euros pertenecientes a 12 clases distintas de miosina en el genoma humano^3,4. Los miembros de las clases de miosina desempeñan diversos papeles en un conjunto muy diverso de trastornos, como varios tipos de cáncer, trastornos neurológicos, miopatías esqueléticas y cardiomiopatía hipertrófica^5,6. Dado el gran número de funciones fisiológicas y patológicas de estos motores moleculares, no es de extrañar que se estén volviendo cada vez más reconocidos como objetivos farmacológicos para una variedad de condiciones⁷. Recientemente se han realizado progresos significativos en el descubrimiento de nuevos inhibidores de la miosina^8,9,10 y activadores^11,y para mejorar las propiedades de los existentes^{12, 13 , 14 , 15}.

El ensayo ATPase acoplado a la nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) se ha utilizado durante mucho tiempo para medir la actividad ATPase de varias enzimas, como la bomba sarcoplasmática reticulum Ca²⁺ ATPase¹⁶, la reparación de ADN ATPase Rad54¹⁷, la AAA+ ATPase p97¹⁸ o la quinesina motora microtúbula¹⁹. El ensayo emplea un ciclo de regeneración ATP. El difosfato de adenosina (ADP) generado por la ATPase se regenera a ATP por piruvato quinasa (PK), que transforma una molécula de fosfoenolpiruvato (PEP) a piruvato en paralelo. Posteriormente, el piruvato se reduce a lactato por lactato deshidrogenasa (LDH). Eso, a su vez, oxida una molécula de NADH a NAD. Por lo tanto, la disminución en la concentración de NADH en función del tiempo es igual a la tasa de hidrólisis ATP. El ciclo de regeneración de ATP mantiene la concentración de ATP casi constante y la concentración de ADP baja siempre y cuando PEP esté disponible. Esto da como resultado cursos de tiempo lineales, por lo que es fácil determinar las tasas de reacción inicial y ayuda a evitar la inhibición del producto por ADP¹⁹. Aunque el ensayo ATPase acoplado a NADH ya se ha adaptado a un formato de 96 pozos^20,los altos volúmenes de reacción (-150 l) lo hacen relativamente caro debido a la alta demanda de reactivos, lo que lo hace menos apto para un cribado rápido de grandes Compuestos. Los métodos alternativos, como el ensayo verde de malaquita^19,21, que se basa en la detección del fosfato producido por la enzima ATPase, se demostraron más adecuados para la miniaturización y el cribado de alto rendimiento^{22 , 23 , 24}. Sin embargo, es más probable que un ensayo de punto final se vea afectado por varios artefactos (que se describen a continuación), que pueden permanecer sin descubrir se descubierta en ausencia de cursos de tiempo completo.

Aquí, el ensayo ATPase acoplado a NADH se ha optimizado para la detección de rendimiento semi-alto de inhibidores de moléculas pequeñas. La miosina muscular esquelética y cardíaca II y los inhibidores de la miosina blebbistatin⁸, para-aminoblebbistatin¹³ y para-nitroblebbistatin¹² se utilizan para demostrar el poder del ensayo, que se basa en NADH fluorescencia como una lectura. Este protocolo es susceptible de cribado de proyectos centrados en cualquier enzima que produzca ADP.