מיצוי הקורטיזול של החדקן פין ואת עצם הלסת מטריצות
Summary
במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול להפקת קורטיזול מן הסנפיר ואת עצם הלסת של מינים חדקניים. פין והלסת רמות קורטיזול נבדקו נוסף על ידי השוואת שני ממיסים כביסה ואחריו אליסה assays. מחקר זה מנווט את הכדאיות של עצם הלסת קורטיזול כמו אינדיקטור מתח הרומן.
Abstract
מטרות מחקר זה היו לפתח טכניקה להפקת קורטיזול מתוך סנפירים חדקניים באמצעות שני ממיסים כביסה (מים איזופנול) ולכמת את כל ההבדלים רמות קורטיזול סנפיר בין שלושה המינים העיקריים חדקניים. סנפירים נקצרו מ 19 sturgeons הוקרב כולל שבעה בלוגה (huso huso), שבעה סיבירי (acipenser baerii), ו חמש סרומגה (א. stellatus). הsturgeons הועלו בחוות איראניות במשך שנתיים (2017-2018), וניתוח הוצאת קורטיזול נערך בדרום קוריאה (ינואר-פברואר 2019). ג’ווונז מ 5 ה. huso שימשו גם להפקת קורטיזול. הנתונים נותחו באמצעות הליך המודל הליניארי (GLM) הכללי בסביבת SAS. מקדמי הווריאציה הפנים והבין-שונות של וריאציה היו 14.15 ו-7.70, בהתאמה. בקצרה, שיטת החילוץ קורטיזול מעורב כביסה את הדגימות (300 ± 10 מ”ג) עם 3 מ ל של ממס (מים באולטרטהורים ו איזופנול) פעמיים, סיבוב ב 80 rpm עבור 2.5 דקות, ייבוש האוויר הדגימות שנשטפו בטמפרטורת החדר (22-28 ° c) במשך 7 ימים, ייבוש נוסף דגימות באמצעות מקצף חרוז ב 50 Hz עבור 32 דקות ושחיקה אותם אבקה, החלת 1.5 mL מתנול לאבקה מיובש (75 ± 5 מ”ג), וסיבוב איטי (40 rpm) עבור 18 h בטמפרטורת החדר עם ערבוב רציפה. בעקבות החילוץ, דגימות היו centrifuged (9,500 x g עבור 10 דקות), ו-1 mL supernatant הועבר צינור מיקרוצנטריפוגה חדש (1.5 mL), הדגירה ב 38 ° צ’ כדי להתאדות את מתנול, וניתח באמצעות האנזים מקושר אנזימים מחובר בדיקות (אליסה) . הבדלים לא נצפו ברמות הקורטיזול סנפיר בין מינים או בתוך סנפיר והלסת רמות קורטיזול בין שטיפת ממיסים. התוצאות של מחקר זה להפגין כי מטריצה הלסת החדקן הוא מחוון מתח אלטרנטיבי מבטיח מטריצות מוצק.
Introduction
קורטיזול הוא מחוון אמין של מתח בעלי חיים. מיצוי הקורטיזול מספק מסגרת תקפה לחוקרים לניטור רמות הלחץ ודפוסים כלליים של התוקפים. לדוגמה, מחקרים קודמים ניהלו אימות מתודולוגי של מדידות קורטיזול שיער באמצעות שיטות שונות בבני אדם1,2, קופים3,4, בקר5, כבשים6, ו דג זהב7,8. במינים של דגים, מדידות קורטיזול בתוך מטריצות כגון קשקשים, ריר העור, צואה, ו9 דם הוכחו לספק מידע על בריאות הדגים. כאשר דגימת דם היא בעייתית או קשקשים חסרים, מטריצות חלופיות עבור חילוץ קורטיזול נחוצים. בדגים, מטריצות חלופיות יכולות לכלול את עצם הלסת, רקמה קשה הדומה להשן האנושית10.
הפיתוח של מטריצות חדשות וטכניקות מאומת כדי לקבוע את רמות הלחץ של דגים הוא עניין מיוחד לתעשיית הקוויאר, שם חדקן יכול לחוות חשיפה ממושכת לגורמי הלחץ הסביבתי11. לא ניתן לקבוע את מין החידקן לפני גיל שנתיים, ולחדקן אין קשקשים. בגלל הקורטיזול בהדרגה מצטבר מטריצות מוצק בשלב הצמיחה2,7,12, לטווח ארוך הצטברות קורטיזול נתונים מתוך מטריצות קשות כגון סנפירים ובעצמות הלסת יכול לספק תובנה לחץ רמות בשלבי צמיחה שונים. לעומת זאת, רמות הקורטיזול של דם לספק תמונה של רמות הלחץ בזמן המוות ולא יכול במדויק לייצג לחץ במהלך הגידול לטווח ארוך13,14. עם הגוברת התחרות בשוק הקוויאר, גישות חדשות כדי לשפר את תנאי הלחץ לייצור של ביצים בריאות בין מינים חדקניים במהלך הגידול לטווח ארוך (8-12 שנים או יותר) הם אזור חשוב יותר ויותר של מחקר. בשל העלות הגבוהה של חדקן, דגימות שנקטפו יקרים מאוד ($ 8000-15000 לכל דג בוגר בהתאם למינים ולשלב הצמיחה), גורם מגביל עבור פרויקטים מחקר. עם זאת, התפתחות הטכניקה המתאימה להפקת קורטיזול מן הסנפירים החדקניים והלסת יכול להיות שימושית באופן מלא הן מערכות חקלאיות דגים בדגים בר כדי לשפר את האיכות והקציר של ביצי חדקן עבור הצריכה ו שימור.
כמו גם מתן תוצאות אמינות6, הבחירה של טכניקה מתאימה לחילוץ קורטיזול היא בעלת חשיבות קריטית כדי להבטיח כי תרכובות אחרות הקיימות במטריקס במהלך הכנת המדגם לא לבלבל את התפוקה, אשר עשוי להוביל ל תוצאות לא עקביות. זה חשוב באותה מידה לקבוע אם הפין ואת הלסת רמות קורטיזול מושפעים רמות ההורמונים במים המקיפים. היימבורה ואח ‘15 הציע כי מספר גורמים עשויים להשפיע על רמות קורטיזול כולל גיל, מין, הריון, העונה, צבע12, אזור הגוף שממנו הקורטיזול מחולץ16. עם זאת, מידע קטן זמין על ההשפעות של כביסה ממיסים על הפקת קורטיזול בתוך מטריצות הגוף דגים8, ואף אחד על ההשפעות האלה בחדקן, למעט ביצים חדקן17.
למרות ניתוח רמות קורטיזול בסיסית מן הסנפירים והלסת של החידקן דורש כי הדגים להיות מורדמים, גישה זו אינה כרוכה הטכניקות פולשני הדרושים לדגימת דם ב חדקן חי. הדגימות פין ואת עצם הלסת נאספים בקלות, והפקת מרקמות אלה ניתן לבצע במהירות. באופן דומה, חילוץ הורמון וניתוח הם פשוטים ודורשים ציוד מיוחד קטן.
במחקר זה, אנו מציגים טכניקה חדשה ומיושם בקלות עבור החילוץ, כביסה, ונחישות של קורטיזול מן הדגים סנפירים והלסת, במטרה לקבוע אם רמות הקורטיזול נמדד מטריצות אלה ניתן להשתמש באופן אמין כמתח אינדיקטורים. היתרונות של טכניקה זו כוללים גישה קלה ולא פולשנית8 , פחות וריאציה נתונים, פלט אמין1,6,8,17; הטכניקה מתאימה למינים של דגים ללא קשקשים כגון חדקן. הטכניקה דורשת טבח של הדג, מבחר של ממיסים כביסה המתאים2,4, שחיקה נכונה של דגימות3,5, מקצועי מקושר אנזימים מקושרים בדיקות (אליסה) יישום5,7, וידע נרחב של התאגדות של מקורות קורטיזול לתוך מטריצות מוצק6.
התחלנו שני ממיסים שונים כביסה (מים באולטרסאונד ואיזופנול) כדי להשיג רמות קורטיזול בסיס של סנפירים מ שלושה מינים חדקניים: בלוגה (huso huso), סיבירי (acipenser baerii), ו סבראגה (א. סטאטוס ), בתנאים סביבתיים סטנדרטיים לכל מין. ג’ווונז של ה. huso היו גם שימשו כדי להעריך את הלחץ בחדקן. זהו המחקר הראשון למדוד רמות קורטיזול ב חדקן ג’ווונז. תוצאות מחקר זה יספק נתונים קורטיזול השוואתי עבור מינים חדקניים בשלב הצמיחה המוקדמת (~ 1 שנה) לפני קביעת מין.
Protocol
Representative Results
Discussion
חדקניים נקרא לפעמים “מאובן חי” כי זה הציג עיבודים מעטים במהלך אלפי שנים האחרונות. הסוג החדקן מכיל 27 מינים המייצרים קוויאר; עם זאת, שלושה מינים (בלוגה, baerii, ו סברוגה) לייצר את רוב האספקה הגלובלית של קוויאר. החדקניים חשופים לדיג יתר ולהפרעות בסביבתם הטבעית ולכן הם בסכנת הכחדה אנושות יותר מ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נערכה בתמיכת תוכנית המחקר השיתופי למדעי החקלאות & פיתוח טכנולוגיה (כותרת פרוייקט: שינוי פרודוקטיביות במשק החי עם שינויי האקלים, Project No. PJ012771), המינהל הכפרי לפיתוח, הרפובליקה של קוריאה. כמו כן, מחקר זה היה נתמך על ידי מענק (לא. PJ01344604) מצוות התזונה של בעלי חיים & פיזיולוגיה, המכון הלאומי למדעי החי, RDA, סאול, הרפובליקה של קוריאה. המחברים מכירים בהכרת התנועה הפרסית המנכ ל מוחמד חסן סלמנדה וצוותו, שסיפק דגים משלושת המינים המנוקניים שנבחנו במחקר זה.
Materials
| Disposal latex surgical gloves | Ansell | 63754090 |
| Platform scale-electronic weighing 100kg | Baskoolnikoo | 101 EM |
| Serological pipette to deliver up to 24 mL | Becton Dickinson Falcon | 35-7550 |
| Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters | BioTek | 8041000 |
| Reagent reservoirs | BrandTech | 703459 |
| Zipper storage plastic bag | Cleanwrap | 30cm x100m |
| Isopropyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5035-4400 |
| Methyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5558-4100 |
| Tube rotator- MX-RL-Pro | DLAB Scientific | 824-222217777 |
| Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL | Eppendorf Research Plus | M21518D |
| Precision pipette to deliver 15 and 25 μL | Eppendorf Research Plus | R25623C |
| Weighing paper (107 x 210 mm) | Fisherbrand | 09-898-12B |
| Bead beater, 50/60 Hz 2A | GeneReach Biotechnology Corp | tp0088 |
| Plate rotator with orbit capable of 500 rpm | Hangzhou Miu Instrument | MU-E30-1044 |
| Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL | Hyundai Micro | H20050 |
| Fume hood | Kwang Dong Industrial | KD 901-22128175 |
| Micro-centrifuge capable of 1500 x g | Labo Gene | 9.900.900.729 |
| Mini vortex mixer | LMS | VTX-3000L |
| Lotte aluminum foil roll | Lotte Aluminum | B0722X5FK5 |
| Digital scale | Mettler Toledo | ME204 |
| Ultrapure water | MDM | MDM-0110 |
| Pipette tips | Neptune Scientific | REF 2100.N |
| Large fish net | Pond H2O | Hoz135 |
| Salivary cortisol kit | Salimetrics | 1-3002-4 |
| Bone cutting forceps | Sankyo | 26-188A |
| Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL | VITLAB | 18A68756 |
| Towel | Yuhan Kimberly | 1707921546 |
| Tissue paper (107 × 210) | Yuhan Kimberly | 41117 |
Riferimenti
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Ghassemi Nejad, J., et al. A cortisol study: facial hair and nails. Journal of Steroids Hormonal Sciences. 7, 1-5 (2016).
- Meyer, J. S., Novak, M. A., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147, 255-261 (2006).
- Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Park, H. K. Methodological validation of measuring Hanwoo hair cortisol concentration using bead beater and surgical scissors. Journal of Animal Science and Technology. 61, 41-46 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Wool cortisol is a better indicator of stress than blood cortisol in ewes exposed to heat stress and water restriction. Animal. 8, 128-132 (2014).
- Brossa, A. C. . Cortisol in skin mucus and scales as a measure of fish stress and habitat quality. Ph.D. dissertation. , (2018).
- Carbajal, A., et al. Cortisol detection in fish scales by enzyme immunoassay: biochemical and methodological validation. Journal of Applied Ichthyology. 34, 1-4 (2018).
- Bertotto, D., et al. Alternative matrices for cortisol measurement in fish. Aquaculture Research. 41, 1261-1267 (2010).
- Ghassemi Nejad, J., Jeong, C., Shahsavarani, H., Sung, I. K., Lee, J. Embedded dental cortisol content: a pilot study. Endocrinology & Metabolic Syndrome. 5, 240 (2016).
- Pankhurst, N. W. The endocrinology of stress in fish: an environmental perspective. General and Comparative Endocrinology. 170, 265-275 (2011).
- Ghassemi Nejad, J., Kim, W. B., Lee, B. H., Sung, K. I. Coat and hair color: hair cortisol and serotonin levels in lactating Holstein cows under heat stress conditions. Animal Science Journal. 88, 190-194 (2017).
- Baker, M. R., Gobush, K. S., Vynne, C. H. Review of factors influencing stress hormones in fish and wildlife. Journal of Nature Conservation. 21, 309-318 (2013).
- Aerts, J., et al. Scales tell a story on the stress history of fish. PLoS One. 10, e0123411 (2015).
- Heimbürge, S., Kanitz, E., Otten, W. The use of hair cortisol for the assessment of stress in animals. General and Comparative Endocrinology. , 10-17 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Comparing hair cortisol concentrations from various body sites and serum cortisol in Holstein lactating cows and heifers during thermal comfort zone. Journal of Veterinary Behavior: Clinical and Application Research. 30, 92-95 (2019).
- Bussy, U., Wassink, L., Scribner, K. T., Li, W. Determination of cortisol in lake sturgeon (Acipenser fulvescens) eggs by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1040, 162-168 (2017).
- SAS. 1999. . SAS. User’s Guide (Version 8.01 Edition). , (1999).
- Barton, B. A. Stress in fishes: a diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids. Integrative and Comparative Biology. 42, 517-525 (2002).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Measuring hair and blood cortisol in sheep and dairy cattle using RIA and ELISA assay: a comparison. Biological Rhythm Research. Accepted. , (2019).
