Identificación de mutaciones por fusión de alta resolución en una población de arroz
Summary
En este artículo, presentamos el protocolo que se describe como análisis de fusión de alta resolución (HRM) basado en lesiones locales inducidas por objetivos en genomas (TILLING). Este método utiliza cambios de fluorescencia durante la fusión del dúplex de ADN y es adecuado para el cribado de alto rendimiento tanto de inserción/eliminación (Indel) como de substición de base única (SBS).
Abstract
Las lesiones locales inducidas por el objetivo en los genomas (TILLING) es una estrategia de genética inversa para el cribado de alto rendimiento de mutaciones inducidas. Sin embargo, el sistema TILLING tiene menos aplicabilidad para la detección de inserción/eliminación (Indel) y TILLING tradicional necesita pasos más complejos, como la digestión nucleasa CEL I y la electroforesis de gel. Para mejorar el rendimiento y la eficiencia de selección, y para hacer posible el cribado tanto de Indels como de substiciones de base única (SBS), se desarrolla un nuevo sistema TILLING basado en fusión de alta resolución (HRM). Aquí, presentamos un protocolo HRM-TILLING detallado y mostramos su aplicación en el cribado de mutaciones. Este método puede analizar las mutaciones de los amplicons de PCR midiendo la desnaturalización del ADN de doble cadena a altas temperaturas. El análisis HRM se realiza directamente después de PCR sin procesamiento adicional. Además, un método de extracción de ADN simple, seguro y rápido (SSF) se integra con HRM-TILLING para identificar tanto Indels como SBSs. Su simplicidad, robustez y alto rendimiento lo hacen potencialmente útil para la exploración de mutaciones en arroz y otros cultivos.
Introduction
Los mutantes son importantes recursos genéticos para la investigación de genómica funcional vegetal y la cría de nuevas variedades. Un enfoque genético directo (es decir, desde la selección mutante hasta la clonación genética o el desarrollo de variedades) solía ser el método principal y único para el uso de mutaciones inducidas hace unos 20 años. El desarrollo de un nuevo método de genética inversa, TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes) de McCallum et al.1 abrió un nuevo paradigma y desde entonces se ha aplicado en un gran número de especies animales y vegetales2. TILLING es particularmente útil para los rasgos de reproducción que son técnicamente difíciles o costosos de determinar (por ejemplo, resistencia a enfermedades, contenido mineral).
TILLING fue desarrollado inicialmente para mutaciones de puntos de detección inducidas por mutágenos químicos (por ejemplo, EMS1,3). Incluye los siguientes pasos: el establecimiento de una(s) población(es) TILLING; Preparación del ADN y agrupación de plantas individuales; Amplificación pcR del fragmento de ADN objetivo; heteroduplexes la formación por desnaturalización y recocido de los amplicones de PCR y la escisión por nucleasa CEL I; y la identificación de los individuos mutantes y sus lesiones moleculares específicas3,4. Sin embargo, este método sigue siendo relativamente complejo, consume mucho tiempo y de bajo rendimiento. Para hacerlo más eficiente y con un mayor rendimiento, se han desarrollado muchos métodos TILLING modificados, como la eliminación TILLING (De-TILLING) (Tabla1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.
El análisis de curvas HRM, que se basa en cambios en la fluorescencia durante la fusión del dúplex de ADN, es un método simple, rentable y de alto rendimiento para el cribado de mutaciones y el genotipado13. HRM ya ha sido ampliamente utilizado en la investigación de plantas incluyendo TILLING basado en HRM (HRM-TILLING) para el cribado de mutaciones SBS inducidas por EMS mutagenesis14. Aquí, presentamos protocolos detallados de HRM-TILLING para el cribado de mutaciones (tanto Indel como SBS) inducidas por rayos gamma en el arroz.
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLING ha demostrado ser una poderosa herramienta genética inversa para identificar mutaciones inducidas para el análisis funcional de genes y la reproducción de cultivos. Para algunos rasgos que no se observan o determinan fácilmente, TILLING con detección de mutaciones basadas en PCR de alto rendimiento puede ser un método útil para obtener mutantes para diferentes genes. El método HRM-TILLING se ha utilizado en poblaciones mutadas en EMS de tomate12,trigo11 y vi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional De Investigación y Desarrollo Clave de China (No. 2016YFD0102103) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.31701394).
Materials
| 2× Taq plus PCR Master Mix | Tiangen, China | KT201 | PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification |
| 96-well plate | Bio-rad, America | MSP-9651 | Specific plate for PCR in HRM analysis |
| Mastercycler nexus | Eppendorf, German | 6333000073 | PCR amplification |
| LightScanner | Idaho Technology, USA | LCSN-ASY-0011 | For fluorescence sampling and processing |
| CALL-IT 2.0 | Idaho Technology, USA | For analysis of the fluorescence change | |
| EvaGreen | Biotium, USA | 31000-T | Fluorescence dye of HRM |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific, USA | ND2000 | For DNA quantification |
Riferimenti
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