Identifier les mutations par fusion à haute résolution dans une population de riz de TILLING
Summary
Dans cet article, nous présentons le protocole qui est décrit comme l’analyse de fusion à haute résolution (HRM)-basée Sur les lésions locales induites par la cible dans les génomes (TILLING). Cette méthode utilise des changements de fluorescence lors de la fusion du duplex d’ADN et convient au dépistage à haut débit de l’insertion/suppression (Indel) et de la sous-stition de base unique (SBS).
Abstract
Les lésions locales induites par la cible dans les génomes (TILLING) est une stratégie de génétique inversée pour le criblage à haut débit des mutations induites. Cependant, le système TILLING a moins d’applicabilité pour l’insertion / suppression (Indel) détection et traditionnelle TILLING a besoin d’étapes plus complexes, comme CEL I la digestion nucléase et l’électrophorèse gel. Afin d’améliorer l’efficacité du débit et de la sélection, et de rendre possible le dépistage des indels et des sous-stits de base unique (SBS), un nouveau système TILLING à haute résolution est mis au point. Ici, nous présentons un protocole détaillé HRM-TILLING et montrons son application dans le criblage de mutation. Cette méthode permet d’analyser les mutations des amplicons PCR en mesurant la dénaturation de l’ADN à double brin à des températures élevées. L’analyse de la MRH est effectuée directement après la PRC sans traitement supplémentaire. De plus, une méthode d’extraction d’ADN simple, sûre et rapide (SSF) est intégrée à HRM-TILLING pour identifier les Indels et les SBS. Sa simplicité, sa robustesse et son débit élevé le rendent potentiellement utile pour la numérisation des mutations dans le riz et d’autres cultures.
Introduction
Les mutants sont d’importantes ressources génétiques pour la recherche en génomique fonctionnelle des plantes et l’élevage de nouvelles variétés. Une approche génétique avancée (c.-à-d. de la sélection mutante au clonage génétique ou au développement de variétés) était la principale et la seule méthode pour l’utilisation des mutations induites il y a environ 20 ans. Le développement d’une nouvelle méthode de génétique inversée, TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes) par McCallum et coll.1 a ouvert un nouveau paradigme et il a depuis été appliqué dans un grand nombre d’espèces animales et végétales2. TILLING est particulièrement utile pour les caractères de reproduction qui sont techniquement difficiles ou coûteux à déterminer (p. ex., résistance aux maladies, teneur en minéraux).
TILLING a été initialement développé pour les mutations de points de dépistage induites par les mutagènes chimiques (p. ex., SME1,3). Il comprend les étapes suivantes : l’établissement d’une population DE TILLING(s); Préparation de l’ADN et mise en commun de plantes individuelles; Amplification pcR du fragment d’ADN cible; formation d’hétéroduplexes par dénaturation et annealing des amplicons de PCR et du clivage par la nucléase de CEL I ; et l’identification des individus mutants et de leurs lésions moléculaires spécifiques3,4. Cependant, cette méthode est encore relativement complexe, longue et faible débit. Pour le rendre plus efficace et avec un débit plus élevé, de nombreuses méthodes DE TILLING modifiées ont été développées, telles que la suppression DETILLING (De-TILLING) (Tableau 1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.
L’analyse de la courbe de la MRH, qui est basée sur les changements de fluorescence lors de la fusion du duplex d’ADN, est une méthode simple, rentable et à haut débit pour le dépistage des mutations et le génotypage13. La MRH a déjà été largement utilisée dans la recherche sur les plantes, y compris la MRH TILLING (HRM-TILLING) pour le dépistage des mutations SBS induites par la mutagénèse du SME14. Ici, nous avons présenté des protocoles détaillés HRM-TILLING pour le criblage des mutations (Indel et SBS) induites par les rayons gamma () dans le riz.
Protocol
Representative Results
Discussion
TILLING s’est avéré être un puissant outil génétique inversé pour identifier les mutations induites pour l’analyse fonctionnelle des gènes et la sélection des cultures. Pour certains traits qui ne sont pas faciles à observer ou à déterminer, TILLING avec la détection de mutation à haut débit à base de PCR peut être une méthode utile pour obtenir des mutants pour différents gènes. La méthode HRM-TILLING a été utilisée dans les populations mutagérisées de SME de la tomate12,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par le National Key Research and Development Program of China (No. 2016YFD0102103) et la National Natural Science Foundation of China (No.31701394).
Materials
| 2× Taq plus PCR Master Mix | Tiangen, China | KT201 | PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification |
| 96-well plate | Bio-rad, America | MSP-9651 | Specific plate for PCR in HRM analysis |
| Mastercycler nexus | Eppendorf, German | 6333000073 | PCR amplification |
| LightScanner | Idaho Technology, USA | LCSN-ASY-0011 | For fluorescence sampling and processing |
| CALL-IT 2.0 | Idaho Technology, USA | For analysis of the fluorescence change | |
| EvaGreen | Biotium, USA | 31000-T | Fluorescence dye of HRM |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific, USA | ND2000 | For DNA quantification |
Riferimenti
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