Uso di saggi di ingresso virale e analisi di docking molecolare per l'identificazione di candidati antivirali contro il coxsackievirus A16

La malattia della mano, dell’afta epizootica e della bocca (HFMD) è una malattia più comunemente causata dal coxsackievirus A16 (CVA16) e dall’enterovirus 71 (EV71) nei bambini piccoli. Recentemente in tutta la regione Asia-Pacifico, c’è stato un significativo aumento dell’HFMD indotto da CVA16. Mentre i sintomi possono essere lievi, possono verificarsi gravi complicazioni che colpiscono il cervello e il cuore, con potenziale fatalità^1,2. Attualmente non sono disponibili terapie antivirali o vaccinazioni autorizzate per CVA16, per cui è urgente sviluppare strategie antivirali per frenare i futuri focolai e le relative complicanze.

CVA16 è un virus non inviluppo che ha un capside icosaedrio assemblato da pentamers che contengono ciascuno 4 proteine strutturali vale a dire VP1, VP2, VP3 e VP4. Intorno ad ogni asse di cinque volte nel pentamer è una regione ‘canyon’ che mostra come una depressione ed è nota per il suo ruolo nel legame recettore³. In fondo a questo canyon si trova una tasca idrofobica nella regione VP1 che contiene un ligando grasso naturale chiamato sphingosine (SPH). I recettori cellulari, come il ligando umano P selectin glicoprotein a 1 (PSGL-1) e il membro di classe B (SCARB2) del recettore scaventro, sono stati suggeriti per svolgere un ruolo nell’associazione virale spostando questo ligando che si traduce in cambiamenti conformazionali al successiva espulsione del genoma virale nella cellula ospite^4,5,6. L’identificazione di possibili inibitori che bloccano gli eventi successivi nel processo di ingresso virale potrebbe fornire potenziali strategie terapeutiche contro l’infezione da CVA16.

Le fasi del ciclo di vita del virus possono essere sezionate attraverso approcci sperimentali come obiettivi per aiutare a identificare agenti antivirali specifici della modalità. Un’analisi del tempo di aggiunta di droga esamina l’effetto del trattamento farmacologico in momenti diversi durante l’infezione virale, tra cui l’ingresso preliminare (aggiunto prima dell’infezione da virus), l’ingresso (aggiunto in concomitanza all’infezione da virus) e il post-ingresso (aggiunto a seguito della infezione da virus)⁷. L’impatto può essere valutato utilizzando un saggio standard della placca quantificando il numero di placche virali formate in ciascuna delle condizioni di trattamento. L’andetto di legame virale basato sulla citometria del flusso determina se il farmaco impedisce l’attaccamento virale alle cellule ospiti. Ciò si ottiene spostando la temperatura da 37 gradi centigradi, alla quale si verifica la maggior parte delle infezioni da virus umani, a 4 gradi centigradi, dove i virioni sono in grado di legarsi alla superficie della cellula ospite ma non sono in grado di entrare nelle cellule⁷. Le particelle di virus legate alla membrana cellulare vengono quindi quantificate attraverso l’immunostaining contro gli antigeni virali e valutate in base alla citometria di flusso. L’analisi dell’inattivazione virale, d’altra parte, aiuta a valutare le potenziali interazioni fisiche del farmaco con particelle di virus libere, schermaturando o neutralizzando i virioni, o causando aggregazioni o cambiamenti conformazionali che li rendono inattivi per successive interazioni con la superficie della cellula ospite durante l’infezione^8,9. In questo esperimento, l’inoculo virale è permesso di incubare prima con il farmaco prima di essere diluito per titolare il farmaco prima di infettare il monostrato della cellula ospite ed eseguire un saggio di placca standard⁸. Infine, l’aggancio molecolare è un potente strumento per prevedere potenziali siti di interazione farmacologica sulla superficie del virione, tra cui le glicoproteine virali dei virus avvolti e le proteine capside virali da virus non avvolti, utilizzando il computazionale Algoritmi. Questo aiuta a individuare meccanicamente meccanicamente i bersagli della modalità di azione del farmaco e fornire informazioni utili che possono essere ulteriormente convalidate dai saggi a valle.

Recentemente abbiamo impiegato i metodi sopra descritti per identificare i composti antivirali che bloccavano in modo efficiente l’infezione da CVA16^{9 non}invilita. Qui di seguito, i protocolli dettagliati che sono stati utilizzati sono descritti e discussi.