Visualisation de la dynamique des récepteurs T-Cell de surface à quatre dimensions à l'aide de microscopie à feuilles de lumière en treillis

La dynamique précise du trafic et de la diffusion des molécules sur la surface tridimensionnelle des cellules en temps réel a été une énigme à résoudre. La microscopie a toujours été un équilibre de vitesse, de sensibilité et de résolution; si un ou deux sont maximisés, le troisième est minimisé. Par conséquent, en raison de la petite taille et de la vitesse immense avec laquelle les récepteurs de surface se déplacent, le suivi de leur dynamique est resté un défi technologique majeur dans le domaine de la biologie cellulaire. Par exemple, de nombreuses études ont été menées à l’aide de la microscopie interne totale de fluorescence (TIRF)^1,2,3, qui a une résolution temporelle élevée, mais ne peut imager qu’une tranche très mince de la membrane des lymphocytes T (100 nm), et manque donc des événements qui se produisent plus loin dans la cellule. Ces images TIRF ne montrent également qu’une section bidimensionnelle de la cellule. En revanche, les techniques de super-résolution, telles que la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM)⁴, la microscopie de localisation photoactivée (PALM)⁵, et la microscopie d’épuisement des émissions stimulée (STED)⁶, peuvent surmonter la limite de diffraction de l’abbéenne de la lumière. Ces techniques ont une résolution spatiale élevée (résolution de 20 nm)^4,5,6,7, mais elles prennent souvent de nombreuses minutes pour acquérir une image bidimensionnelle complète (2D) ou tridimensionnelle (3D), et donc la résolution temporelle est perdue. En outre, des techniques telles que STORM et PALM qui reposent sur des signaux clignotants peuvent avoir des inexactitudes dans le comptage^8,9. La microscopie électronique a de loin la plus haute résolution (jusqu’à 50 h de résolution)¹⁰; il peut même être effectué en trois dimensions avec la microscopie électronique focalisée de balayage de faisceau d’ions (FIB-SEM), ayant pour résultat jusqu’à 3 nm XY et 500 nm Z résolution^11. Cependant, toute forme de microscopie électronique nécessite une préparation d’échantillons rigoureux et ne peut être menée qu’avec des cellules ou des tissus fixes, éliminant ainsi la possibilité d’imagerie d’échantillons vivants au fil du temps.

Les techniques pour obtenir la résolution spatiotemporal élevée exigée pour identifier la dynamique des molécules de surface et intracellulaires dans les cellules vivantes dans leur vraie nature physiologique 3D sont seulement récemment développées. Une de ces techniques est Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)¹², qui utilise une feuille de lumière structurée pour réduire considérablement photoblanchiment. Développé en 2014 par le prix Nobel Eric Betzig, la haute résolution axiale, le faible photoblanchiment et le bruit de fond, et la capacité d’imager simultanément des centaines d’avions par champ de vision font des microscopes LLS supérieurs aux microscopes widefield, TIRF et confocal^{12,13,14,15,16,17,18,19}. Cette technique d’imagerie en quatre dimensions (x, y, z et temps), bien que toujours limitée à la diffraction (résolution XYZ de 200 nm), a une résolution temporelle incroyable (nous avons atteint un taux d’image d’environ 100 fps, résultant en une image cellulaire reconstruite en 3D avec 0,85 seconde par image) pour l’acquisition spatiale 3D.

LLSM peut généralement être utilisé pour suivre la dynamique en temps réel de toutes les molécules dans n’importe quelle cellule au niveau monomolécule et unicellulaire, en particulier ceux dans les cellules très motiles telles que les cellules immunitaires. Par exemple, nous montrons ici comment utiliser LLSM pour visualiser la dynamique des récepteurs des lymphocytes T (TCR). Les lymphocytes T sont les cellules effectrices du système immunitaire adaptatif. Les TCR sont chargés de reconnaître les ligands peptide-MHC (pMHC) affichés à la surface des cellules présentant des antigènes (APC), qui déterminent la sélection, le développement, la différenciation, le sort et la fonction d’une cellule T. Cette reconnaissance se produit à l’interface entre les lymphocytes T et les APC, résultant en un regroupement localisé des récepteurs pour former ce qu’on appelle la synapse immunologique. Bien qu’il soit connu que les TCR à la synapse immunologique sont impératifs pour la fonction effector de Cellule T, encore inconnus sont les mécanismes sous-jacents du trafic en temps réel de TCR à la synapse. LLSM nous a permis de visualiser en temps réel la dynamique des TCR avant et après le trafic à la synapse avec l’interaction pMHC-TCR qui en résulte (Figure 1). LLSM peut donc être utilisé pour résoudre les questions actuelles de la dynamique formatrice des TCR et fournir des idées pour comprendre comment une cellule fait la distinction entre l’individu et les antigènes étrangers.