使用莱迪思光片显微镜可视化表面 T-Cell 受体动力学四维
Summary
该协议的目的是演示如何使用莱迪思光片显微镜对活细胞中的四维可视化表面受体动力学进行可视化。这里显示了CD4+初级T细胞上的T细胞受体。
Abstract
细胞的信号和功能由其表面受体的动态结构和相互作用决定。为了真正了解这些受体在原位的结构-功能关系，我们需要在具有足够时空分辨率的活细胞表面可视化和跟踪它们。在这里，我们展示如何使用最近开发的莱迪思光片显微镜（LLSM）在活细胞膜上以四维（4D、空间和时间）成像T细胞受体（TDR）。T细胞是自适应免疫系统的主要效应细胞之一，在这里，我们以T细胞为例，表明这些细胞的信号和功能是由TDR的动态和相互作用驱动的。LLSM 允许以前所未有的时空分辨率进行 4D 成像。因此，这种显微镜技术通常可以应用于生物学中不同细胞的多种表面或细胞内分子。
Introduction
分子在三维细胞表面实时贩运和扩散的精确动力学是一个需要解决的难题。显微镜一直是速度、灵敏度和分辨率的平衡;如果任何一个或两个最大化，第三个最小化。因此，由于表面受体移动的体积小、速度极快，跟踪其动力学仍然是细胞生物学领域的一项重大技术挑战。例如，许多研究都是使用总内部反射荧光（TIRF）显微镜1，2，3，具有高时间分辨率，但只能成像T细胞膜（+100nm）的非常薄的切片，因此错过了在细胞更远发生的事件。这些 TIRF 图像也只显示细胞的二维部分。相比之下，超分辨率技术，如随机光学重建显微镜（STORM）4、光活化定位显微镜（PALM）5和刺激发射损耗显微镜（STED）6，可以克服Abbe衍射光极限。这些技术具有高空间分辨率（+20 nm分辨率）4，5，6，7，但它们通常需要几分钟才能获得完整的二维（2D）或三维（3D）图像，因此时间分辨率会丢失。此外，像STORM和PALM这样的依赖闪烁信号的技术在计数8、9中可能有不准确之处。电子显微镜具有迄今为止最高的分辨率（高达50pm分辨率）10;它甚至可以进行三维与聚焦的电束扫描电子显微镜（FIB-SEM），导致高达3纳米XY和500纳米Z分辨率11。然而，任何形式的电子显微镜都需要严酷的样品制备，只能用固定细胞或组织进行，从而消除了随时间而成像活样本的可能性。
获得识别活细胞中表面和细胞内分子动力学所需的高时空分辨率的技术，在真正的生理三维性质中，最近才得到开发。其中一种技术是莱迪思光片显微镜（LLSM）12，它利用结构化的光片来大大降低光漂白。由诺贝尔奖获得者Eric Betzig于2014年开发，高轴向分辨率，低光漂白和背景噪声，并能同时成像数百平面每个视场，使LLS显微镜优于宽场，TIRF和共聚焦显微镜12，13，14，15，16，17，18，19。这种四维（x、y、z 和时间）成像技术虽然仍然衍射受限（±200 nm XYZ 分辨率），但具有令人难以置信的时间分辨率（我们实现了约 100 fps 的帧速率，从而为 3D 空间采集构建了 0.85 秒的 3D 重建单元图像）。
LLSM通常用于跟踪单分子和单细胞水平下任何细胞内任何分子的实时动态，尤其是高活动细胞（如免疫细胞）中的分子。例如，我们在这里演示如何使用 LLSM 来可视化 T 细胞受体 （TCR） 动力学。T细胞是适应性免疫系统的效应细胞。TDR 负责识别抗原呈现细胞 （APC） 表面显示的肽-MHC （pMHC） 配体，它确定 T 细胞的选择、发育、分化、命运和功能。这种识别发生在T细胞和APC之间的接口，导致局部受体聚类形成所谓的免疫突触。虽然众所周知，免疫突触中的 TCR 对于 T 细胞效应器功能至关重要，但仍然未知实时 TCR 贩运到突触的基本机制。LLSM 使我们能够通过产生的 pMHC-TCR 交互作用实时可视化 TDR 在贩运到突触之前和之后的动态（图 1）。因此，LLSM可用于解决TDR形成动力学的当前问题，并提供见解，以了解细胞如何区分自身和外来抗原。
Protocol
Representative Results
Discussion
针对从5C分离的CD4+ T细胞的使用，对所呈现的协议进行了优化。C7转基因小鼠在LLSM仪器上使用，因此其他细胞系统和LLSM可能需要以不同的方式优化。然而，该协议显示了4D成像的力量，因为它可以用来量化整个细胞表面受体的动态，在生理条件中失真最小。因此，这种技术有许多可能的未来应用。
关键步骤是允许细胞以适当的浓度沉降。如果太多的 APC 在盖玻上安顿?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢芝加哥大学的维塔斯·宾多卡博士的建议和指导。我们感谢芝加哥大学综合光显微镜核心设施支持和维护晶格光片显微镜。这项工作得到了NIH新创新者奖1DP2AI144245和NSF职业奖1653782（至J.H.）的支持。J.R.由NSF研究生研究奖学金计划支持。
Materials
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | For T cell harvest |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | For T cell culture |
| 5 mm round coverslips | World Precision Instruments | 502040 | For Imaging |
| 70um Sterile Cell Strainer | Corning | 7201431 | For T cell harvest |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody | BioLegend | 109215 | For Imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | X&Y Cell Culture | FBS-500 | For T cell culture |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Denisty gradient reagent for T cell harvest |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | For microscope alignment |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres | Thermo Fisher Scientific | F8810 | For microscope alignment |
| Imaris | Bitplane | N/A | Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji). |
| Lattice Light-Sheet Microscope | 3i | N/A | Microscope Used |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 21083027 | For Imaging |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | For T cell culture |
| LLSpy | Janelia Research Campus | N/A | LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/ |
| Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK | Elimbio | Custom Synthesis | For T cell harvest |
| Penacillin/Streptamycin | Life Technologies | 15140122_3683884612 | For T cell culture |
| Poly-L-Lysine | Phenix Research Products | P8920-100ML | For Imaging |
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | For T cell harvest |
| Recombinant mouse IL-2 | Sigma-Aldrich | I0523 | For T cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT10040CV | For T cell culture |
| Slidebook | 3i | N/A | LLSM imaging software |
| Surgical Dissection Tools | Nova-Tech International | DSET10 | For T cell harvest |
| T-25 Flasks | Eppendorf | 2231710126 | For T cell culture |
| Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits | Thermo Fisher Scientific | 44685 | For preparing Fab |
Riferimenti
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