Olomotor sinir gelişimi için zaman aşımı görüntüleme için embriyonik GFP-Ifade fareler dan ex vivo okülomotor dilim kültürü
Summary
Bir ex vivo dilim tahlil gerçek zamanlı olarak görüntülenmiş olmak okülomotor sinir büyüme sağlar. Dilim E 10.5 ISLMN katıştırarak oluşturulur: agarose ‘de Gfp embriyolar, bir vibratom üzerinde dilimleme, ve bir aşama-üst kuluçç büyüyen. Axon rehberlik yollarının rolü, kültür ortamına inhibitörler ekleyerek değerlendirilir.
Abstract
Doğru göz hareketleri görme için çok önemlidir, ancak özellikle Akon rehberliğini kontrol eden moleküler yollar olan oküler motor sisteminin gelişimi tamamen elükidated değildir. Bu kısmen geleneksel Akon rehberlik özellikleri teknik sınırlamaları kaynaklanmaktadır. Okülomotor sinirini etkileyen ek Akon rehberlik ipuçlarını belirlemek için, bir ex vivo dilim tahlil gerçek zamanlı olarak okülomotor sinir görüntü için göz doğru büyüdükçe gelişti. E 10.5 ISLMN-Gfp embriyoları agarose içine katıştırarak ex vivo dilimleri oluşturmak için kullanılır, bir vibratome üzerinde dilimleme, daha sonra 24-72 h için zaman atlamalı photomikroskopisi ile bir mikroskop sahne-üst inküdosu onları büyüyen. kontrol dilimleri yeniden apitüle çekirdeğden yörüngeye kadar akonların gelişiminin in vivo zamanlaması. Farklı Akon rehberlik yollarının rolünü değerlendirmek için kültür medyasında küçük molekül inhibitörleri veya rekombinant proteinler eklenebilir. Bu yöntem, akons geçiş, büyüyen akons axotomizing değil, ve onların yörünge boyunca birden fazla puan içinde akons değerlendirmek yerel mikroçevre daha fazla bakımını avantajları vardır. Ayrıca, akons belirli alt kümeleri üzerindeki efektleri belirleyebilir. Örneğin, CXCR4 inhibisyonu orta beyin içinde hala dorsal yerine ventriketten büyümek için aksonlar neden olur, ama zaten ventriketden çıkıldı akons etkilenmez.
Introduction
Oküler motor sistemi, Akon rehberlik mekanizmalarını araştırmak için zarif bir sistem sağlar. Bu nispeten karmaşık değildir, üç kraniyal sinirler altı olağanüstü kasları innerve oluşan (eoms) hangi göz hareket, ve levator palpebrae Superioris (LPS) hangi göz kapağı kaldırır. Okülomotor sinir LPS ve dört EOMs innervates-inferior eğik ve medial, inferior, ve üstün rekus kasları. Diğer iki sinirler, trochleer ve kaçırır, her biri sadece bir kas, üstün eğik ve lateral rekus kası, sırasıyla inler. Göz hareketleri, innervasyon uygun, eksik veya aberrant olup olmadığını gösteren, kolay bir okuma sağlar. Ayrıca, nöronal gelişim veya Akon rehberliğinde eksiklikleri sonucu insan gözü hareket bozuklukları vardır, topluca konjenital kranial disinnervasyon bozuklukları (CCDDs)1olarak adlandırılır.
Bu avantajları rağmen, oküler motor sistemi nadiren Axon rehberlik çalışmaları kullanılır2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10, teknik dezavantajları nedeniyle. In vitro Axon rehberlik birçok dezavantajları11olduğunu gösteriyor. Co-kültür, hangi nöronal Method birlikte hedef doku (12 veya transfekte hücreler13, eksplant hem simetri ve eksplant ve hedef doku arasında kesin konumlandırma bağlı olarak kültürsüz olduğunu gösteriyor. Stripe,14,15, hangi iki ipuçlarını değişen çizgili ve akons bir şerit üzerinde Tercihli büyüme için değerlendirilir, sadece bir substrat diğer için tercih edilir, ya da çekici olduğunu gösterir veya fizyolojik olarak ilgilidir. Microfluidics Chambers kesin kimyasal degradeler oluşturabilir, ama konu büyüyen akons kesme stres16,17,18, hangi büyümesini etkileyebilir. Dahası, bu yaklaşımların her birinde, Method veya ayrışmış hücrelerin toplanması, büyüyen akbitlerin axotomize edilmesi ve bu nedenle, ilk Aksiyon büyümesi yerine Axon rejenerasyonunu incelemenizi gerektirir. Son olarak, bu in vitro yaklaşımlar akons ve onların ders farklı noktalar boyunca ipuçlarına tepkiler etkiler mikroçevre kaldırmak ve geleneksel olarak sadece yalıtım bir işaret test. Bu dezavantajları compounding, oküler motor sisteminde her çekirdeğin küçük boyutu diseksiyon teknik ya Method veya Disosiye kültürler için zorlu yapar. Ayrıca, oküler motor nöronların primer kültürler genellikle heterojen, önemli hücre ölümü var, ve yoğunluk bağımlıdır, birden fazla embriyodan hücrelerin havuzu gerektiren (Ryosuki Fujiki, kişisel iletişim). In vivo yöntemleri, ancak, nakavt fare modelleri de dahil olmak üzere, tarama için kullanmak için uygunsuz, zaman ve masraf gerekli verilen.
Tüm embriyolar kültür için geliştirilen yöntemleri19 göç hücrelerin etiketleme izin20 veya belirli moleküllerin blokajı21, ancak tüm embriyo kültürler etiketli gerçek zamanlı görüntüleme engelleyen silindir şişeleri kuluçlan gerektirir Yapı. Embriyonun manipülasyonuna izin veren cerrahi teknikler ve sonra da uterusa veya annenin karında (plasental bağlantının korunması)22 de mümkündür, ancak bu da zaman atlamalı izin vermez Görüntüleme.
İn vitro asdların engelleri aşmak ve sinyalizasyon yollarının hızlı taramasına izin vermek için, bir ex vivo Embriyonik dilim kültürü tekniği geliştirilen23, periferik sinir gelişimi için daha önce yayımlanan bir protokol adapte24. Bu protokolü kullanarak, gelişmekte olan okülomotor siniri, EOM hedefleri de dahil olmak üzere yörüngesi boyunca çevreleyen yapıların çoğunun varlığında zamanla görüntülenmiş olabilir. Kültür ortamına küçük molekül inhibitörleri, büyüme faktörleri veya rehberlik ipuçları ekleyerek, Aksiyon yörünge boyunca birden fazla noktadan rehberlik perturbations değerlendirebiliriz, potansiyel büyüme ve rehberlik faktörleri daha hızlı değerlendirilmesi sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu ex vivo dilim kültür Protokolü geleneksel Akon rehberlik üzerinde önemli avantajlar sağlar23diyor. Her kranial motor çekirdeğin büyüklüğü sınırlayıcı bir faktör değildir ve zor bir diseksiyon gereklidir. Akons seyahat korunur endojen mikroçevre, diğer sinyalizasyon yolları korurken bir sinyal yolu modifikasyonu sağlar. Ayrıca, efektler Akon yörünge boyunca farklı noktalarda değerlendirilebilir. Axon rehberlik birden fazla ipuçları ve ipuçları kombinasyonları, yo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansman Ulusal göz Enstitüsü tarafından sağlanan [5K08EY027850], çocuk sağlığı ve gelişimi Ulusal Enstitüsü [U54HD090255], Harvard-Vision klinik bilim adamı geliştirme programı [5K12EY016335], şövalyeler göz Vakfı [kariyer Starter Grant] ve Çocuk Hastanesi Oftalmoloji Vakfı [Fakülte keşif Ödülü]. ECE, Howard Hughes Tıp Enstitüsü müfettişi.
Materials
| 24-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 6-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) | VWR | 14672-200 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Fluorobrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | |
| Glucose (200 g/L) | Thermo Fisher Scientific | A2494001 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550H | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| L-Glutamine (250 nM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Loctite Superglue | Loctite | ||
| Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520050 | |
| Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) | Millipore Sigma | PICM03050 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri Dish (100 x 15mm) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical Scissors – Blunt | Fine Science Tools | 14000-12 | |
| Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF | Nikon | ||
| Vibratome (VT 1200S) | Leica | 1491200S001 | |
| Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) | Ted Pella, Inc. | 121-6 |
Riferimenti
- Whitman, M. C., Engle, E. C. Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance. Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).
- Giger, R. J., et al. Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins. Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).
- Chen, H., et al. Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections. Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Cheng, L., et al. Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling. Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).
- Tischfield, M. A., et al. Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance. Cell. 140 (1), 74-87 (2010).
- Kim, M., et al. Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction. Biologia dello sviluppo. 399 (1), 68-79 (2015).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).
- Ebendal, T., Jacobson, C. O. Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia. Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).
- Dazert, S., et al. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro. Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).
- Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons. Development. 101 (4), 909-913 (1987).
- Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).
- Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture. Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).
- Keenan, T. M., Folch, A. Biomolecular gradients in cell culture systems. Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).
- Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. Tangential migration in neocortical development. Biologia dello sviluppo. 244 (1), 155-169 (2002).
- Miquelajauregui, A., et al. LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).
- Garcia-Pena, C. M., et al. Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).
- Ngo-Muller, V., Muneoka, K. In utero and exo utero surgery on rodent embryos. Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative ophthalmology & visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth. Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).
- Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. Initial tract formation in the mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).
- Michalak, S. M., et al. Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).
- Lewellis, S. W., et al. Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay. The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).
- Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).
