Ex Vivo Oculomotor Slice Культура от эмбриональных GFP-Expressing мышей для Time-Lapse Imaging Oculomotor Нерв Рост

Глазная моторная система обеспечивает элегантную систему для исследования механизмов наведения аксона. Это относительно несложный, состоящий из трех черепных нервов, иннервирующих шесть экстраокулярных мышц (EOMs), которые двигают глаз, и леватор palpebrae superioris (LPS), который поднимает век. Окуломоторный нерв иннервирует LPS и четыре EOMs – нижние косые и медиальный, нижний, и превосходные мышцы прямой кишки. Два других нерва, trochlear и abducens, каждый только innervate одной мышцы, выше косой и боковой мышцы прямой кишки, соответственно. Движения глаз обеспечивают легкое считывание, показывая, если иннервация была уместной, отсутствует, или аномальные. Кроме того, Есть человеческие расстройства движения глаз, которые являются результатом дефицита в развитии нейронов или аксон руководства, коллективно называют врожденные расстройства дезиннервации черепа (CCDDs)¹.

Несмотря на эти преимущества, глазная моторная системаредко используется в исследованиях аксона 2,^{3,4,5,6, 8, 9 До 9 , 10}, из-за технических недостатков. In vitro axon руководство анализы имеют много недостатков¹¹. Анализы сокультуры, в которых нейрональные экспланты культивируются вместе с высадками целевой ткани¹² или транс-инфицированных клеток^13,зависят как от симметрии экспланта, так и от точного позиционирования между эксплантировой и целевой тканью. Полоса анализы^14,15, в котором два сигнала изложены в чередующихся полос и аксонов оцениваются для преференциального роста на одной полосе, только указывают, что один субстрат предпочтительнее другого, не то, что либо является привлекательным или отталкивающим, или физиологически актуальным. Microfluidics камеры могут образовывать точные химические градиенты, но при условии выращивания аксонов сдвига стресс^16,17,18, которые могут повлиять на их рост. Кроме того, в каждом из этих подходов, сбор explants или диссоциированных клеток требует, чтобы перерастания аксонов быть акотомизированы и, таким образом, эти анализы на самом деле изучить аксон регенерации, а не первоначальный аксон рост. Наконец, эти подходы in vitro удаляют микросреду, которая влияет на аксоны и их реакцию на сигналы по разным точкам их курса, и традиционно тестируют только один сигнал в изоляции. Усугубляя эти недостатки, небольшой размер каждого ядра в глазной двигательной системе делает вскрытие технически сложным для эксплантированных или диссоциированных культур. Кроме того, первичные культуры глазных моторных нейронов, как правило, неоднородны, имеют значительную гибель клеток, и зависят от плотности, требуя объединения клеток из нескольких эмбрионов (Ryosuki Fujiki, личное общение). In vivo методы, однако, в том числе нокаут мыши модели, не уместны для использования для скрининга, учитывая время и расходы, необходимые.

Методы, разработанные для культуры целых эмбрионов¹⁹ позволяют маркировки мигрирующих клеток²⁰ или блокады конкретных молекул²¹, но целые культуры эмбриона требуют инкубации в роликовых бутылках, что исключает в режиме реального времени изображения помечены Структуры. Хирургические методы, которые позволяют манипуляции эмбриона, а затем последующее дальнейшее развитие либо в матке или в брюшной полости матери (поддержание плацентарной связи)²² также возможны, но они также не позволяют промежуток времени Изображений.

Чтобы преодолеть препятствия in vitro анализы и позволяют быстрый скрининг сигнальных путей, ex vivo эмбриональных срез культуры техника была разработана²³, адаптированы из ранее опубликованного протокола для периферических нервных нарастания²⁴. Используя этот протокол, развивающийся окуломоторный нерв может быть изображен с течением времени в присутствии многих окружающих структур по его траектории, включая цели EOM. Добавляя небольшие молекулярные ингибиторы, факторы роста или сигналы руководства к культурным носителям, мы можем оценить возмущения руководства в нескольких точках вдоль траектории аксона, что позволяет более быстро оценивать потенциальные факторы роста и руководства.