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Bioingegneria

Redes humanas de cardiomiócitos derivadas de iPSC em matrizes de microeletrodos Multipoços para gravações em potencial de ação recorrente

Published: July 15, 2019
doi:
10.3791/59906
, , , ,
1Aurora Research Institute,Advocate Aurora Health Care, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering and Applied Science,University of Wisconsin-Milwaukee, 3Department of Medicine-Cardiovascular, School of Medicine,Johns Hopkins University

Summary

Este artigo contem um jogo dos protocolos para o desenvolvimento de redes pluripotentes induzidas humanas do cardiomiócito (hipsc-cm) cultivadas em placas de de mea para electroporate reversivelmente a membrana de pilha para medidas do potencial da ação. Gravações de alta taxa de transferência são obtidas dos mesmos sites de célula repetidamente ao longo dos dias.

Abstract

A triagem de segurança cardíaca é de suma importância para a descoberta e terapêutica medicamentosa. Conseqüentemente, o desenvolvimento de aproximações electrofisiológicas high-throughput novas para as preparações hiPSC-derivadas do cardiomiócito (hiPSC-CM) é muito necessário para o teste de droga eficiente. Embora as matrizes do multieletrodo (MEAs) sejam empregadas freqüentemente para medidas potenciais do campo de pilhas excitável, uma publicação recente por Joshi-Mukherjee e por colegas descreveu e validou sua aplicação para gravações do potencial de ação periódica (AP) da mesma preparação hiPSC-CM ao longo dos dias. O objetivo aqui é fornecer métodos detalhados passo-a-passo para a semeadura de CMs e para a medição de formas de onda AP via eletroporação com alta precisão e uma resolução temporal de 1 μs. Esta abordagem aborda a falta de metodologia fácil de usar para obter acesso intracelular para medições de AP de alta taxa de transferência para investigações eletrofisiológicas confiáveis. Um fluxo de trabalho detalhado e métodos para chapeamento de hipsc-CMS em placas de mea são discutidos enfatizando etapas críticas sempre que relevante. Além disso, um script MATLAB personalizado para manipulação rápida de dados, extração e análise é relatado para investigação abrangente da análise de forma de onda para quantificar diferenças sutis na morfologia para vários parâmetros de duração de AP implicados em arritmia e cardiotoxicidade.

Introduction

Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hipsc-CMS) são o padrão-ouro para um número crescente de laboratórios1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Batendo corpos embrióides11,12,13 e monocamada3,7,10,11,12, 13,14,15,16,17 a diferenciação são os métodos preferidos para a produção de cardiomiócitos e o arranjo multieletrodo (mea) tornou-se uma modalidade comum para o monitoramento da eletrodinâmica dessas redes18,19,20. Enquanto os parâmetros que podem ser extraídos de potenciais de campo (FPS), como taxa de batimento, amplitude, duração e intervalos RR, são Respostas eletrofisiológicas de linha de base de monocamadas espontaneamente batendo18,21, 22,23, os componentes do potencial de ação (AP) subjacentes a esses sinais de FP extracelulares são difíceis de extrapolar24. Nossa publicação recente na descoberta de uma aplicação de MEAs para medidas periódicas diretas do AP fornece a prova da metodologia para leituras intracelular exemplares do AP com uma análise extensiva da forma de onda em várias fases do repolarização através de múltiplo lotes de redes de cardiomiócitos derivados do hiPSC3. No estudo Nós demonstramos que a entrega de pulsos electroporating às redes de cardiomiócitos hipsc-derivados permite o acesso intracelular para gravações do AP. Estas gravações transientes do AP são dependentes das recuperações potenciais do transmembrana observadas através do local da lesão3,25,26. As formas de onda registradas via MEA e patch-Clamp em nosso estudo mostraram morfologias de AP semelhantes, validando a confiabilidade da abordagem3.

Alguns laboratórios relataram a medição de APS de várias células eletrogênicas usando personalizado-construído MEAs18,21,26,27,28,29, 30, mas a confiabilidade do uso de MEAs para medições consistentes e recorrentes de AP não foi avaliada. Atualmente, a técnica do remendo-grampo do padrão do ouro é limitada às gravações do terminal7,31 visto que, as medidas mea-baseadas AP são transientes e conseqüentemente podem ser conduzidas várias vezes na mesma pilha. Nós igualmente mostramos que um pode facilmente gravar sinais de alta qualidade do AP na escala do milivolt que exige a filtração mínima. Os pesquisadores podem, portanto, conduzir não apenas estudos agudos, mas também crônicos, nas mesmas preparações usando MEAs. Adicionalmente, esta tecnologia permite a medida simultânea de FP/AP que gera bibliotecas do electro-bioma em um curto período de tempo. Dada a crescente ênfase na predição da arritmia e cardiotoxicidade associada à medicina24,32,33,34,35, integração da medida AP melhorar a segurança e a eficácia das drogas.

Aqui, apresentamos protocolos para 1) Pré-chapeamento de hipsc-CMS criopreservado para maturação, 2) dissociação e plaqueamento de hipsc-CMS em de MEAs, 3) gravação de fps e APS de redes hipsc-cm, 4) segmentando e extraindo os dados para análise, e 5) restaurando os arrays para reutilização múltipla. Cada etapa foi otimizada enfatizando etapas críticas sempre que relevante. As exigências para o acessório da pilha para assegurar um monocamada sincicial batendo são discutidas e os procedimentos para a restauração de de mea para estudos electrofisiológicos repetitivos são explicados. Finalmente, uma GUI personalizada desenvolvida no laboratório é apresentada para extração de sinal AP, garantia de qualidade e fluxo de trabalho de segmentação para quantificar e analisar parâmetros de AP.

Protocol

1. preparação de soluções e materiais (ver tabela de materiais) 6-poço de tecido-cultura placa substrato-revestimento Descongelar o substrato de revestimento no gelo ou a 4 ° c. Prepare uma diluição de substrato de revestimento 1:100 em meio DMEM/F12 frio. Misture a solução por pipetagem lenta. Transfira 2 mL da solução de substrato de revestimento (passo 1.1.2) por poço de uma placa de cultura de tecido de 6 poços. Coloc imediatamente a placa revestida da cultura do tecido na incubadora da cultura da pilha em 37 ° c e em 5% CO2 para pelo menos 7 h e uso dentro de 7 dias. hiPSC-CM meio de cultura Adicione 10 mL de suplemento de mídia CM descongelado a 4 ° c a 500 mL de meio de base CM. Conservar a 4 ° c por até 2 semanas. Alíquota necessária quantidade de mídia para o dia e trazer para a temperatura ambiente antes de usar. meio de descongelar de hiPSC-CM: Prepare fresco misturando o meio de cultura de hiPSC-CM (etapa 1,2) com o soro bovino fetal de 10% (FBS). Leve a mídia à temperatura ambiente antes de descongelar de CMs para suspensão. Fibronectin 1 mg/ml solução: alíquota 200 μl em 1,5 ml de tubos de microcentrífuga estéreis e armazenados a 4 ° c para uso posterior. Prepare a solução de trabalho de 50 μg/mL de concentração fresca no gelo. Solução de limpeza multipoços: Combine 0,5 g de detergente enzimático com 50 mL de água destilada dupla estéril (ddH2O). Vortex para misturar o conteúdo. Filtre e armazene a 4 ° c por até uma semana. 2. Pré-chapeamento de hiPSC-CM criopreservado para maturação (Figura 1) Nota: Esta seção destina-se a descongelar e cultivar hipsc-CMS que foram diferenciados usando o método de monocamada livre de alimentador3,16 e criopreservado em nitrogênio líquido 10 dias após a diferenciação em 1-2 milhões de células/frasco. As pilhas de um frasco são chapeadas em dois poços substrato-revestidos de uma placa da cultura do tecido 6-well. Os cardiomiócitos tendem a se estabelecer na parte inferior do tubo tão suave mistura no momento do Pré-chapeamento é importante para alcançar a densidade celular mesmo através de poços. Alíquota 2 mL de FBS por frasco de hiPSC-CMs sendo descongelado em um tubo cônico de 15 mL e trazer à temperatura ambiente. Descongelar frascos de hiPSC-CMs criopreservado colocando-os em um banho de água de 37 ° c e redemoinho suavemente para até mesmo descongelar por não mais de 3 min. Transfira imediatamente o conteúdo do frasco para injetáveis para o tubo contendo FBS (ver passo 2,1), misture girando e centrifugue a 200 x g durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuscite o pellet celular em 1 ml de hipsc-cm descongelamento médio (ver passo 1,3) por frasco descongelado. Use uma pipeta de transferência para ressuscitação do pellet por trituração suave. Avaliar a viabilidade celular. Adicione 3 ml adicionais de meio de descongelar por frasco de hipsc-cm descongelado na etapa 2,4 e suspenda suavemente usando uma pipeta de transferência para dissociar ainda mais os aglomerados de células. Dispense suavemente 2 mL de suspensão celular em cada poço de placas de 6 poços revestidas com substrato (ver passo 1,1). Lugar na incubadora da cultura de pilha em 37 ° c e em 5% CO2. Substitua com o meio de cultivo fresco do hiPSC-CM após 24 h e 3 vezes semanais depois disso por 20 dias.Nota: as células devem aderir ao revestimento de substrato por 24 h e bater espontaneamente em 48 h pós-chapeamento (ver vídeo 1 e vídeo 2). 3. esterilização e revestimento de placas multiwell MEA (Figura 2 e Figura 3) Nota: o protocolo descrito aqui é para preparar 24-bem MEA placas com 12 micro ouro PEDOT-eletrodos revestidos em vidro para hiPSC-CM chapeamento. Evite tocar na parte inferior da placa, pois isso pode danificar os eletrodos. Dois dias antes do chapeamento de pilha, adicionam 0,5 mL do meio de cultura do hiPSC-CM (veja a etapa 1,2) a cada poço e executam uma gravação da linha de base para verific a relação do sinal-à-ruído para a verificação da qualidade das MEAs. Aspirar os meios de comunicação, enxaguar com ddH estéril2o e esterilizar luz UV dentro de uma capa de fluxo laminar durante a noite. O dia anterior ao chapeamento de pilha, adiciona 0,1 mL de FBS a cada poço para o tratamento hidrófilo de superfícies de MEA. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Esta etapa é necessária para o acessório da pilha. Aspirar o FBS e enxaguar com 0,5 mL de ddH estéril2O por poço. Repita mais uma vez. Deixe a placa secar na capa do fluxo laminar durante a noite. Prepare uma diluição de trabalho de 50 μg/mL de fibronectina em meio DMEM/F12 frio do estoque (ver etapa 1,4). Mantenha a solução no gelo. Pipetar 5 μL da diluição de fibronectina de trabalho (ver 3,6) e dispensar cuidadosamente a gota ao centro de cada poço para cobrir todos os 12 eléctrodos. É importante trabalhar rapidamente através dos 24 poços para impedir que a gota seque. Coloque imediatamente a placa de mea revestida com fibronectina sobre uma superfície levantada dentro de uma câmara de umidificação contendo DDH2o estéril para cobrir toda a superfície do prato. Coloque a câmara com a placa mea de para 3 h na incubadora da cultura celular.Nota: a colocação da placa mea de 24 poços numa câmara de umidificação é fundamental para evitar que as gotas de fibronectina SECem durante o período de incubação. 4. dissociação e chapeamento de hiPSC-CM na placa multiwell MEA (Figura 3) Nota: Comece esta etapa aproximadamente 1 h antes da incubação do fibronectina do MEA está completa. Assegure-se de que a solução da dissociação da pilha esteja em 37 ° c e o meio de descongelar de iPSC-CM esteja na temperatura ambiente. Os métodos de dissociação foram otimizados por 30 dias pós-diferenciados de hiPSC-CMs cultivados em placas de 6 poços revestidas com substrato (ver etapa 2) para obter cerca de 90% de CMs viável para o revestimento MEA. Deve-se tomar cuidado para não introduzir bolhas de ar durante a trituração para evitar a morte celular. Aspirar o meio de cultura de cada poço do prato de cultura de tecido de 6 poços com cultura hiPSC-CM pós-diferenciada de 30 dias (ver passo 2,7) e lavar com 2 mL de D-PBS estéril por poço. Adicionar 1 mL de solução de dissociação de células pré-aqueceu (ver tabela de materiais) por poço e incubar durante 4 min a 37 ° c. Use uma pipeta de transferência para triturar suavemente para afrouxar as células para dissociação. Se a maioria das células ainda estiverem aderentes, incubar por mais 3 min a 37 ° c e triturar novamente. Esta incubação adicional deve ajudar para a recuperação máxima da pilha. Não incubar por mais de 7 min, pois isso pode resultar em baixa viabilidade celular. Usando uma pipeta de transferência, a associação de todas as células dissociadas em um tubo cônico contendo hiPSC-CM descongelar médio (ver passo 1,3). Recomenda-se suspender as células em pelo menos duas vezes o volume de mídia (2 mL por poço que está sendo colhido) para bloquear a atividade da solução de dissociação celular. Centrifugador a 200 x g durante 5 min. Aspirar a solução com cuidado como o pellet é frouxamente anexado à superfície e ressuspender em 0,1 mL de hiPSC-CM descongelar médio. Use uma pipeta de transferência para ressuscitação do pellet algumas vezes por trituração suave. Alíquota 2 μL de células dissociadas e diluir com 18 μL de Media num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 20 μL de trypan Blue e misturar para contagem de células e avaliação de viabilidade. Ajuste a densidade celular para 6.000 células/μL adicionando o volume apropriado de meio de descongelar hiPSC-CM. Suspenda a pelota por flicking suave algumas vezes. O hiPSC-CMs facilmente desanexar de superfícies de vidro, especialmente quando banhado em altas densidades. Nós otimizamos a densidade de semeadura e condições de chapeamento para atingir 15 dias de gravações elétricas. Quando estiver pronto, coloque a placa mea de na capa de fluxo laminar para a semeadura de células. É crítico para executar os seguintes dois passos um bem de cada vez para evitar a fibronectina de secagem. Retire cuidadosamente a gota de fibronectina utilizando uma pipeta P10 sem tocar nos eléctrodos. Dispensar imediatamente uma gota da pilha de 5 μL (30.000 pilhas) ao centro do poço da placa de MEA que cobre todos os 12 elétrodos. Repita a etapa até que todos os 24 poços estejam chapeados. Recomenda-se a mistura intermitente de suspensão celular por flicking. Coloc a placa do de mea para trás na câmara umidificação frouxamente coberta e retorne à incubadora da cultura da pilha em 37 ° c e em 5% co2 para 3 h para o acessório da pilha. Adicione com cuidado 200 μL do meio de descongelar do hiPSC-CM a cada poço sem perturbar as pilhas usando uma pipeta P200. Adicione a mídia gota gota ao lado do poço. Coloque a placa mea de de volta na incubadora da cultura celular. Substitua com meio de cultura fresco de hiPSC-CM em 24 h de revestimento do borne. O batimento espontâneo dos cardiomiócitos pode ser observado neste ponto (ver vídeo 3). Mude a mídia a cada 2 dias até o final dos experimentos. 5. electroporação de hiPSC-CM e aquisição de sinais (figuras 4 – 6) Nota: Este protocolo é para a gravação simultânea de sinais de eletrodo de alta taxa de transferência (12 locais para cada um dos 24 poços). O sistema mea de de 24 poços é utilizado com o software de aquisição (ver tabela de materiais). Todas as gravações de MEA são conduzidas em 37 ° c. Ative a placa de interface e inicie o software de aquisição. Aguarde tempo suficiente para que o cabeçote de mea atinja a temperatura de 37 ° c (veja a seta n º 1 na Figura 4). Insira a placa mea de a partir do passo 4 no headstage de mea de colocando-a coberta sobre a plataforma de gravação e clique no botão Inserir (veja a seta n º 2 na Figura 4). Deixe a temperatura estabilizar antes de iniciar as gravações. Ajuste as configurações de aquisição e eletroporação Clique no ícone definir fluxo experimental (veja a seta n º 3 na Figura 4) e defina o tempo de gravação para 2 min ou como desejado. Clique no ícone de configuração de aquisição de dados (consulte a seta n º 4 na Figura 4) e defina a taxa de amostragem para 20 kHz, filtro passa-alta para 0,1 Hz e filtro passa-baixa para 3500 Hz. Clique no ícone configurações do estimulador (veja a Figura 5). Na guia definição de estímulo , defina a estimulação como pulsos bifásica de tensão simétrica de 1 mV, 1 ms e 1 Hz. a guia eletrodos de estimulação , selecione sites de eletroporação destacando todos os eletrodos relevantes. Clique no botão explorar para visualizar os sinais em todos os poços. Verifique a qualidade do sinal e condições de estado estacionário. Tome notas sobre eletrodos com sinais FP na faixa de mV. Clique no mesmo botão para interromper a exploração. Nenhum dado foi gravado até este ponto. Inicie a gravação clicando no botão go! Os eletrodos em cada poço mostrarão sinais FP na janela de dados brutos (Figura 6). Após 30 s da gravação, estale sobre a tecla do estímulo e permita que o electroporation ocorra nos locais selecionados para 30 s; em seguida, clique no mesmo botão para parar a estimulação e continuar a gravação para os restantes 60 s.Nota: o arquivo gravado pode ser reproduzido alternando para ‘ modo Replayer ‘ no menu suspenso ‘ aplicativo ‘. 6. multiwell MEA limpeza da placa para reutilização Após as experiências finais, limpe todos os poços na placa de aspirando todos os conteúdos de mídia de cada poço e evitando cuidadosamente tocar a superfície do eletrodo. Adicionar 1 mL de ddH estéril2O por poço. Aspirar e repetir uma vez. Adicionar 0,3 mL de solução de limpeza multipoços (ver passo 1,5) por poço. Incubar durante a noite à temperatura ambiente para desalojar células e detritos. Na manhã seguinte, aspirar a solução e enxaguar com 1 mL de ddH estéril2o. Incubar por 5-7 min e aspirar. Repita 5 vezes. Adicionar 0,5 mL de ddH estéril2O por poço. Registre a linha de base da placa de multipoços limpa para verificar a qualidade das MEAs limpas (Figura 7). Conservar a 4 ° c até estar pronto a utilizar. 7. conversão e exportação de arquivos de dados Observação: quatro arquivos de dados serão gerados para cada gravação: MWR, MWC, MWD e MWS arquivos. Usando o software do conversor, o arquivo MWD pode ser convertido em arquivo H5 para análise subsequente usando script personalizado (consulte o arquivo complementar 1). Inicie o software do conversor (ver tabela de materiais). Selecione Definir caminho de entrada no menu arquivo . Selecione a pasta que contém arquivos de dados de interesse. Selecione Definir caminho de saída no menu arquivo . Selecione a pasta onde os arquivos convertidos devem ser salvos. Destaque arquivo MWD de interesse. Clique no botão exportar para HDF5 . 8. segmentação e análise de dados (figuras 8-10) Observação: o software personalizado baseado em MATLAB é usado para segmentar e extrair vários parâmetros de dados FP e AP. O software está disponível demanda. Execute o código de análise de forma de onda usando o MATLAB (consulte a Figura 8 para ver a janela principal da GUI). Clique em arquivo e selecione processo. H5. Localize e selecione o arquivo MWD. H5 criado de acordo com a etapa 7 acima. Clique no botão salvar diretório para alterar o local de armazenamento dos arquivos de saída. Criar uma fila de processamento de sinal, selecionando eletrodo/bem combinações de interesse e, em seguida, clicando no botão fila . Repita esta etapa para acrescentar mais combinações de eletrodo/poço a serem processadas na fila. Edite a fila clicando diretamente no nome med/concentração med se as células foram tratadas com drogas (Figura 8). Depois que a fila for final, clique no botão inicializar formas de onda . Isso iniciará o processamento preliminar no qual os sinais são identificados e extraídos para segmentação. Clique no botão zoom in e selecione a área de potencial de ação de interesse com o cursor (Figura 9). Clique no botão manter e revise os painéis. Picos (vermelho ‘ x ‘) e calhas (círculos amarelos) são detectados para cada forma de onda e os potenciais de ação normalizados são sobrepostos. Clique no botão manter e mova para o próximo rastreamento na fila (Figura 10). Repita os passos 8.8-8.9 para o resto dos sinais de combinação de eléctrodos/poços na fila.Nota: um arquivo . csv será gerado com parâmetros APD medidos para cada forma de onda. Um arquivo . Mat para cada arquivo . H5 também é salvo para permitir o processamento adicional de dados segmentados.

Representative Results

A viabilidade e a densidade do chapeamento do hipsc-CMS borne-thawed são críticas para a cultura do mea do de. Pré-chapeamento de 1-2 milhões de hiPSC-CMs/frasco para injetáveis em dois poços de uma placa de cultura de tecido 6-bem com 50% ou maior viabilidade produzirá uma cultura de monocamada saudável com batimento espontâneo em 48 h. a má viabilidade dos CMs resultará em culturas com uma elevada percentagem de populações de não-miócitos. Estas monocamada quando dissociada para de mea chapeamento geralmente produzem resultados inconsistentes e sinais de má qualidade e, portanto, deve ser Descartado. A Figura 1 mostra exemplos de culturas de hipsc-CMS ideais versus subideais em 48 h de pós-chapeamento. Thawing o CMS em placas substrato-revestidas da cultura do tecido um pouco do que diretamente no de MEAs, permite a recuperação e a maturação da pilha3. O chapeamento direto de CMs criopreservado na disposição não é recomendado porque produziu resultados inconsistentes. Além da qualidade do CMS dissociado, o acessório celular em mea de é altamente dependente da densidade celular e da técnica de revestimento de fibronectina. O tamanho do gota do fibronectina é crítico porque o CMS conformar-se-á aos limites da área fibronectina-revestida. Por esta razão, apenas 5 μL da solução de fibronectina são dispensados diretamente sobre a área da matriz do eletrodo. Para garantir que a gota não se disperse, a superfície do poço deve estar completamente seca no momento do revestimento. A Figura 2 mostra o layout da placa mea de com esquemas de pré-tratamento passo a passo para uma preparação ideal. Adicionalmente, para evitar que a fibronectina seque as placas MEA multipoços devem ser colocadas dentro de uma câmara de humidificação durante o período de incubação com duração não superior a 3 h (ver passo 3,8). Uma vez que o período de incubação está completo, é importante remover a gota do fibronectina de cada poço apenas antes do chapeamento do CM e somente então para prosseguir ao chapeamento do poço seguinte. Trabalhar rapidamente e dispensar com cuidado do CMs é a chave ao acessório bem sucedido da pilha. as culturas de hipsc-cm aos 30 dias após a diferenciação são dissociadas para o revestimento mea de utilizando o método de dissociação de células enzimáticas (ver passo 4). CMs vai anexar a fibronectina-revestido MEA superfícies por 3 h e uma monocamada cobrindo as matrizes será visível após 24 h pós-chapeamento (Figura 3). A batida synchronous do monocamada será observada em 24-48 h. a dispersão da gota da pilha afetará a densidade da cultura ou mesmo conduzirá à secagem e à morte da pilha. A colocação precisa da pilha diretamente na disposição é da importância máxima e conseqüentemente a técnica deve ser praticada para o chapeamento óptimo. A adesão celular ao eletrodo de referência impedirá a produção de sinais elétricos. Veja Figura 3 para imagens da colocação óptima do cm, e cultura após 24 h. O CMS cultivado em de MEAs é sujeitado à verificação da qualidade para a atividade elétrica no borne-chapeamento de 48 h. Tipicamente, a amplitude do sinal do FP aumenta da escala do μV ao milivolt em aproximadamente 4 dias3. Se 50% dos eletrodos dentro de uma rede e 70% do total de redes não produzem sinais de FP, então a rede ou a cultura são suboptimal e devem ser descartadas. Somente culturas que passam a verificação de qualidade são processadas para análise de FP e AP. A Figura 6 mostra exemplos de sinais FP bons e subpadrão. As gravações de AP mediadas por electroporação podem ser obtidas várias vezes a partir de culturas 48 h pós-mea chapeamento. Empregando o electroporation, nós ganhamos o acesso intracelular para gravar AP High-Resolution das redes hipsc-derivadas múltiplas do cardiomiócito. Pulsos de baixa voltagem (1 V, 1 ms, 1 Hz) por 30 s foram entregues para transformação transitória e reversível do FP para AP. O electroporation permite o acesso intracelular bem sucedido para a medida do AP em aproximadamente 75% dos elétrodos. Os sinais elétricos são gravados por 2 min que incluem 30 s pre-Electroporation, 30 s durante e 1 min post-Electroporation. Um trem de 10 s AP formas de onda 10 s post-Electroporation são avaliados em todos os locais para a qualidade do sinal e análise. Todo o traço que não se conforme ao sinal puro AP é Descartado. Para investigar se as amplitudes AP correlacionam ao sinal do FP nós em todos os 288 locais para gravar simultaneamente formas de onda. Os sinais representativos do FP e do AP gravados do mesmo local de pilha de dois elétrodos diferentes são mostrados na Figura 11a. Não observamos correlação entre as amplitudes do FP e as amplitudes de AP pós-eletroporação registradas no mesmo local da célula. Adicionalmente, as electroporações múltiplas do mesmo local da pilha em 0, 24, 48, 72 e 96 h não tiveram nenhum efeito significativo na forma do AP sobre o tempo (Figura 11B). Dada a natureza de alta taxa de transferência do sistema, uma técnica manual para extrair e quantificar parâmetros de interesse, tais como intervalo RR, frequência instantânea e duração potencial de ação diferencial é ineficiente e demorado. Um script MATLAB personalizado disponível para a comunidade de pesquisa, mediante solicitação, é empregado para executar medições de forma de onda com resolução de 1 μs. Os pontos de tempo de eletroporação são sobrepostos com o sinal extraído para identificar 10 s de AP pós-eletroporação para conduzir a extração de sinal, garantia de qualidade e fluxo de trabalho de segmentação (figura8, figura 9, Figura 10). a interface de usuário permite a seleção do segmento desejado usando os indicadores sobrepostos do Electroporation como um guia. A forma de onda segmentada é processada por sub-rotinas para identificar ainda mais as formas de onda AP individuais. Isto é terminado com a deteção do pico, onde a tensão a mais elevada e a mais baixa é identificada para cada ciclo. Depois que esse processo for concluído, as amplitudes são normalizadas e os vetores de tempo de associação são deslocados para definir o tempo zero em um valor de pico de 1. A interpolação dos pontos de intersecção ao longo dos ciclos individuais foi utilizada para determinar as medidas de APD. Assim, o fluxo de trabalho de automação parcial para a segmentação de forma de onda AP permite análise de dados eficiente para vários parâmetros APD em vários lotes de culturas em um curto período de tempo. Uma maior automatização dos critérios de inclusão e exclusão para FPs e APs está em andamento para análise de dados em tempo real. Uma vantagem significativa da placa mea de é que ele pode ser reutilizado várias vezes. Esta restauração permite Estudos eletrofisiológicos repetitivos para a coleta de dados rentável e consistente. Gravações de APs da mesma matriz após 6 restaurações são mostradas na Figura 12. A relação sinal/ruído é semelhante em várias reutilizações. Para demonstrar a confiabilidade da matriz para Estudos eletrofisiológicos repetitivos, um total de 3815 formas de onda AP são agrupados a partir de três lotes de restauração e dados de duração AP são extraídos para examinar a repetibilidade dos resultados. As parcelas de distribuição para a forma de onda individual APD30, APD80, triangulação (APD80— APD30) e encurtamento fracionário ((APD80— APD30)/(APD80)) são exibidas (Figura 13). Figura 1: Pré-chapeamento de hiPSC-cm criopreservado para maturação. (A) processamento de células para pré-chapeamento 1 frasco de 10 dias pós-diferenciação criopreservado hipsc-CMS. (B) imagens de contraste de fase de culturas hipsc bem-sucedidas (à esquerda) e mal sucedidas (direita). Barra de escala: 275 μm. Veja vídeo 1 e vídeo 2 para exemplos de cultura pós-diferenciação de 14 e 24 dias bem-sucedidos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: configuração e preparação da placa multiwell mea. (A) esquemas MULTIPOÇOS mea Plate: a placa consiste em 24 poços (a1 a D6) contendo 12 matrizes de microeletrodos e 4 eletrodos de referência periférica. Diâmetro do eletrodo: 30 μm/distância entre eletrodos: 300 μm. as gravações podem ser obtidas a partir dos 288 eletrodos simultaneamente. (B) esterilização e etapas de tratamento hidrófilo a ser conduzido antes do chapeamento de hipsc-cm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: dissociação e chapeamento de hiPSC-cm na placa multiwell mea. (A) esquemas de hipsc-cm mea chapeamento passos para cada poço. (B) imagem microscópica ilustrando a colocação correta da gota da pilha que cobre todos os 12 elétrodos sem espalhar aos 4 elétrodos da referência. (C) contraste de fase imagens microscópicas de um exemplar (esquerda) e suboptimal (direita) hipsc-cm que PLATTING em mea em 24 h post-plating. Barra de escala = 275 μm. Veja o vídeo 3 para o exemplo bem sucedido do chapeamento de mea. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: software de aquisição de tela multiwell. As setas indicam a localização dos principais recursos e funções referenciadas no texto: o painel controle de temperatura (1) permite o monitoramento da temperatura em tempo real durante todo o experimento. Botão Inserir/Ejectar (2) engate e liberte a placa multiwell MEA. Definir a função Flow experimental (3) permite que o usuário defina a duração da gravação. A função de configuração de aquisição de dados (4) permite ao usuário definir as configurações de taxa de amostragem e filtro de aquisição. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Hipsc-cm Electroporation e aquisição do sinal . A aba da definição do estímulo permite que o usuário defina os parâmetros de pulso electroporating. A guia eletrodos de estimulação permite que o usuário selecione os eletrodos eletroporantes. Qualquer combinação dos eletrodos 288 pode ser selecionada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: verificação da qualidade das medidas multiwell para a atividade elétrica. Software de aquisição detela multiwell mostrando janelas de dados brutos com exemplos representativos de sinais ideais (A) e subpadrão (B) FP. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7: sinais FP e AP da matriz nova e restaurada. Etapas de limpeza enzimática multiwell MEA (A). O sinal de linha de base da nova matriz mostra a relação sinal/ruído mínima (B) e os sinais FP mostram a atividade elétrica da rede (C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 8: segmentação e análise de dados. Vista da janela principal da GUI para análise de forma de onda. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 9: segmentação e análise de dados. Inicializar botão formas onda para identificar e extrair formas de onda AP para segmentação e para iniciar o processamento preliminar, ampliando e selecionando a área de potencial de ação de interesse. Os círculos vermelhos são os indicadores do Electroporation. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 10: segmentação e análise de dados. Picos (vermelho ‘ x ‘) e calhas (círculos amarelos) são detectados para cada forma de onda e os APs normalizados são sobrepostos para uma verificação de qualidade das formas de onda. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 11: dependência de amplitude AP no sinal FP para várias gravações do mesmo local de célula. A amplitude do FP em escalas do μV (a, painel esquerdo superior) ou escalas do MV (a, painel direito superior) gravada de dois elétrodos independentes produzem a amplitude AP na escala do milivolt (a, painéis esquerdos inferiores e direito) que não mostram nenhuma correlação entre amplitudes do FP e amplitudes do AP do borne-Electroporation. As formas de onda AP normalizadas para cada gravação são sobrepostas como mostrado para cada gravação. Electroporations múltiplos do mesmo local da pilha em 0 a 96 h produziram as formas de onda da alta qualidade AP permitindo o seguimento da electrodinâmica da membrana (B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 12: gravações AP após seis restaurações. As formas de onda AP gravadas simultaneamente 10 s borne-Electroporation através de 12 elétrodos do mesmo poço são indicadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 13: histogramas do parâmetro APD de restaurações múltiplas. Parcelas de distribuição para A forma de onda individual APD30 (A), APD80 (B), triangulação (APD80— APD30) (C) e encurtamento fracionário ((APD80— APD30)/(APD80)) (D) são exibidas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Arquivos suplementares. Vídeos 1-3. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Ao longo dos anos, a aplicação de MEAs limitou-se a realizar medições de FP de células excitável para estudar suas propriedades eletrofisiológicas36,37,38,39. Apenas alguns grupos relataram traços de AP de células eletrogênicas usando a tecnologia baseada em mea personalizada18,29,30. No entanto, essas abordagens não foram investigadas para gravações repetidas das mesmas preparações. Nós desenvolvemos uma metodologia inovadora e precisa para estudar APs a partir do mesmo local de célula ao longo de dias em múltiplas redes hiPSC-CM simultaneamente3. Em nosso estudo publicado, foi empregada uma plataforma de microouro de mea para gerar bibliotecas de forma de onda AP de vários lotes de culturas hipsc-cm com alta precisão e com uma resolução temporal de 1 μs. O protocolo descrito aqui explica a semeadura do hiPSC-CMs na matriz para o desenvolvimento eficiente de redes de CM sincicial para gravações AP de alta taxa de transferência. Várias etapas críticas no protocolo são: 1) produção de vários lotes de alta pureza de CMS de qualidade controlada para a banca de criopreservação, 2) CMS pós-descongelamento altamente viável para pré-chapeamento e maturação, 3) tratamento da placa mea de para cm semeadura, 4) dissociação da cultura hiPSC-CM aos 30 dias pós-diferenciação para o revestimento MEA, e 5) restauração das MEAs para reutilização múltipla.

É importante notar que a variação de lote para lote na diferenciação hiPSC pode afetar os resultados experimentais. O método de diferenciação de monocamada foi otimizado em casa para a produção de cardiomiócitos de alta por cento3,40. A análise de FACS de marcadores MLC2v e TNNT2 de nossas culturas demonstra um ≥ 90% ventricular-como o phenotype3. Essas culturas controladas pela qualidade são criopreservadas para estudos experimentais. As abordagens atuais de diferenciação produzem uma mistura heterogênea de células nodal-, atrial-e ventrículo-like3,16,17,41. Portanto, estratégias empregadas para o enriquecimento da população de subtipo CM podem melhorar ainda mais a especificidade das culturas. Adicionalmente, as aproximações da engenharia do tecido podem ser empregadas para realçar sua maturação. Os métodos propostos aqui podem ser facilmente implementados para outras fontes de CM.

As formas de onda AP registradas usando mea foram semelhantes àquelas registradas de redes de cardiomiócitos por mapeamento óptico42,43, óxido de metal complementar baseado em semicondutores mea18,21, e simulado AP usando gravações FP20. Para endereçar o mecanismo de medidas do AP através de MEA Hai e de Spira25 demonstrou que a relação do electropore-elétrodo imitam a técnica de vidro afiada estabelecida do microelétrodo. No entanto, o potencial de membrana de repouso e os valores de amplitude verdadeiros em nosso estudo não podem ser estabelecidos, uma vez que a interface eletroporo-eletrodo em sistemas MEA não está calibrada, e que a amplitude é uma função da sensibilidade e resolução do Técnica. Nossa abordagem compartilha limitações semelhantes ao mapeamento óptico quando se trata de amplitude AP.

As leituras de FP/AP baseadas em mea de relataram abrir novas possibilidades de avaliação da segurança medicamentosa. Embora espontâneos, estes monocamadas de hipsc-cm batem em taxas constantes. A análise dos parâmetros APD em várias redes fornece insights sobre a heterogeneidade elétrica (Figura 13). No entanto, as análises abrangentes de restituição da APD devem incorporar os intervalos diastólicos precedentes. Além disso, as formas de onda AP de alta qualidade registradas do mesmo local da pilha sobre 96 h (Figura 11B) são o primeiro relatório para controlar a electrodinâmica da membrana sobre o tempo que será do valor no desenvolvimento e na doença.

O protocolo descrito aqui para quantificar parâmetros de AP pode ser usado para gerar curvas dose-resposta para testar compostos. Como relatado recentemente por Edwards et al.3, a resposta da dose de norepinefrina, isoproterenol e e 4031 são plotadas para APD em várias fases de repolarização. O estudo publicado demonstrou a exatidão e a confiabilidade da aproximação para a identificação das mudanças subtis dose-dependentes nas formas de onda AP no tempo real. Esta técnica poderia facilmente ser estendida para outros compostos ou bibliotecas pequenas da molécula para compreender várias respostas electrofisiológicas.

A abordagem baseada em MEA para medidas de AP apresentadas neste estudo será de interesse não só para eletrofisiologistas, mas também para biólogos celulares e modeladores in-silico . Além disso, as gravações FP/AP do mesmo site de células no hiPSC-CMs permitirão que os pesquisadores gerem bibliotecas de dados bioelétricas de grande variedade de redes celulares excitável dentro de um curto período de tempo. A disponibilidade desses recursos será valiosa para as descobertas de medicamentos e a modelagem de doenças.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nenhum

Materials

Accutase Sigma Aldrich A6964-100ML cell dissociation solution
Acquisition software Multichannel Systems Multiwell-Screen v 1.9.2.0
B27 Supplement ThermoFisher 17504-044 CM media supplement
Converter software Multichannel Systems MultiChannel DataManager
DMEM/F12 ThermoFisher 11330-032
D-PBS ThermoFisher 14190-250
FBS Fisher Scientific SH3007103HI
Fibronectin Sigma Aldrich F1141-5MG
Geltrex ThermoFisher A1413202 coating substrate
Interface board Multichannel Systems MCS-IFB 3.0 Multiboot Interface Board
Multiwell MEA Plate Multichannel Systems 24W300/30G-288
RPMI 1640 ThermoFisher 11875-093 CM base medium
Terg-a-zyme Sigma Aldrich Z273287-1EA enzymatic detergent
Transfer pipettes, individually wrapped Fisher Scientific 1371148
Trypan Blue Sigma Aldrich T8154-100ML
Ultrapure sterile water ThermoFisher 10977-023
6-well tissue-culture treated plates Fisher Scientific 08-772-1B
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Zlochiver, V., Kroboth, S. L., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings. J. Vis. Exp. (149), e59906, doi:10.3791/59906 (2019).
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