Ein luziferasefluoreszierendes Reporter-Influenzavirus zur Live-Bildgebung und Quantifizierung von Virusinfektionen

Alle Protokolle, an denen Mäuse beteiligt sind, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) und dem Institutional Biosafety Committee (IBC) der University of Rochester, School of Medicine and Dentistry genehmigt. Alle Tierversuche folgen den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren des National Research Council58. Das Vivarium und die Abteilung für Labortiermedizin an der School of Medicine and Dentistry der University of Rochester ist von der Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) International akkreditiert und den Bundes- und Landesgesetzen und der Politik der National Institutes of Health (NIH) entsprechen. Bei der Arbeit mit Mäusen ist eine ordnungsgemäße persönliche Schutzausrüstung (PSA) erforderlich. Ähnliche Richtlinien und Anforderungen sollten bei der Durchführung von Experimenten umgesetzt werden, die in diesem Manuskript an jeder Institution beschrieben werden. 1. Verwendung von kleinen Wirbeltieren Kaufen Sie fünf bis sieben Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse und halten Sie sie in der Tierpflegeeinrichtung unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen. Wenn Mäuse in die festgelegten Einrichtungen gelangen, lassen Sie 4–5 Tage Ruhezeit ein, damit sich die Tiere an ihre neue Umgebung akklimatisieren können. Legen Sie nach IACUC-Protokollen maximal 5 Mäuse pro Käfig auf.HINWEIS: Um sicherzustellen, dass das Tier tot ist, wurden Mäuse nach Abschluss des Versuchs mit zwei zugelassenen Verfahren eingeschläfert, wobei zu berücksichtigen war, dass das zweite eine physikalische Methode sein muss. In dieser Studie werden Die Tiere nach einer Infektion von Mäusen mit BIRFLU und in vivo-Bildgebung mit einer tödlichen Dosis von 2,2,2-Tribromethanol (TBE) eingeschläfert und die Lebervene als physikalische sekundäre Methode geschnitten, wie wir bisher23gezeigt haben. 2. Biosicherheit HINWEIS: In diesem Manuskript wurde BIRFLU im Rückgrat der Influenza A/Puerto Rico/08/34 H1N1 (PR8) erzeugt, einem gemeinsamen mausangepassten Labor-IAV-Stamm23,32,33,56. Das Virus wurde mit zuvor beschriebenen Plasmid-basierten Reverse-Genetik-Ansätzen und einer vollständigen Beschreibung der Erzeugung erzeugt, und in vitro und in vivo Charakterisierung von BIRFLU finden Sie in unserer aktuellen Publikation55. Alle Verfahren, bei denen Eshandelten (in vitro oder in vivo) sind, wurden in einem biologischen Sicherheitsschrank unter Biosicherheitsniveau (BSL)-2 durchgeführt. ACHTUNG: Ein angemessenes Biosicherheitsniveau sollte im Einklang mit einer Risikobewertung für die biologische Sicherheit festgelegt werden. Zusätzliche Informationen über die Durchführung von Risikobewertungen für die biologische Sicherheit und die Einrichtung einer wirksamen Eindämmung der biologischen Sicherheit sollten mit dem Organ konsultiert werden, in dem die Versuche durchgeführt werden. Reinigen Sie die Biosicherheitsschränke vor und nach durchführung aller experimentellen Verfahren mit 70 % Ethanol- oder Chlordioxid-Desinfektionsmittel. Für Mäuse arbeiten, sterilisieren Sie alle Seziermaterial (Schere, Sezieren Zangen, etc.) und die Dounce Homogenisator vor und nach ihrer Verwendung. Entsorgen Sie das gesamte biologische Material, das während der Verfahren gemäß den entsprechenden IBC- und IACUC-Richtlinien hergestellt wird. 3. In-Vitro-Charakterisierung von BIRFLU (Abbildung 2) HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für alle Puffer- und Medienkompositionen. Analyse der Proteinexpression durch Fluoreszenz (Abbildung 2A) und indirekte Immunfluoreszenz (Abbildung 2B) Einen Tag vor der Infektion Samen 24-Well-Platten mit Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) Epithelzellen (1 x 105 Zellen/ well, Triplicate) in Gewebekultur Medien und pflegen die Platten in einem 37 °C Inkubator mit 5% CO2 . Bereiten Sie genügend Brunnen vor, um alle ausgewählten Antikörper in mock-infizierten und BIRFLU-infizierten Zellen zu bewerten.HINWEIS: Wir empfehlen, die Zellen unter einem Lichtmikroskop zu visualisieren, um eine Monoschicht zu bestätigen, bevor die Virusinfektion beginnt. Es wird eine 90%ige Konfluenzmonoschicht von MDCK-Zellen zum Zeitpunkt der Infektion empfohlen. Bereiten Sie Verdünnungen von WT- oder BIRFLU-IAVs in Infektionsmedien vor und infizieren Sie die ausgesäten MDCK-Zellen mit einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 0,1 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) pro Zelle in einem Endvolumen von 0,25 ml/Well von Infektionsmedien. Entfernen Sie das Gewebekulturmedium aus Schritt 3.1.1 und waschen Sie die MDCK-Zellen zweimal mit 1x phosphatgepufferter Saline (PBS). Fügen Sie die Virusverdünnungen von 3.1.2 zu den MDCK-Zellen hinzu und legen Sie die Platten auf einer Schaukelplattform für 1 h bei Raumtemperatur, um eine virale Adsorption zu ermöglichen.HINWEIS: Mock-infizierte Zellen werden nur mit Infektionsmedien in Abwesenheit von Virus inkubiert. Nach viraler Adsorption (Schritt 3.1.3) entfernen Sie das virale Inokulum durch Aspiration und fügen Sie jedem Brunnen 1 ml Nachinfektionsmedium mit 1 g/ml TPCK-behandeltem Trypsin hinzu. Inkubieren Sie Zellen für 18 h in einem 5% CO2 befeuchteten Inkubator bei 33 °C. Nach 18 h Infektion, entfernen Sie die Gewebekultur Überstand von den 24-Well-Platten (3.1.4). Fixieren und permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,25 ml/Well der Fixations-/Permeabilisationslösung für 20 min bei Raumtemperatur.HINWEIS: Bereiten Sie die Fixierungs-/Permeabilisationslösung in einer Dunstabzugshaube vor, um eine Formaldehyd-Exposition zu verhindern. Entfernen Sie die Fixierungs-/Permeabilisierungslösung aus Schritt 3.1.5, waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS und inkubieren Sie die Zellen mit 0,25 ml/Gut der Blockierlösung für 1 h bei Raumtemperatur.HINWEIS: Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort oder lagern Sie Zellen in einer blockierenden Lösung bei 4 °C über Nacht. Entfernen Sie die Blockierende Lösung (Schritt 3.1.6) und fügen Sie 0,25 ml/Well (1 g/ml) eines monoklonalen Mausantikörpers (MAb) gegen das IAV-Nukleoprotein, NP (HB-65) oder eine 1:1.000 Verdünnung eines polyklonalen Antikörpers (pAb) eines Kaninchens gegen NLuc hinzu (siehe Tabelle der Materialien), in einer Verdünnungslösung (1x PBS, 2,5% BSA) verdünnt und die Zellen für 1 h bei 37 °C inkubieren. Entfernen Sie den primären Antikörper aus Schritt 3.1.7, waschen Sie die Zellen dreimal mit 1x PBS und inkubieren Sie sie mit 0,25 ml/Well eines Texas Red-conjugated Anti-Mouse oder Anti-Rabbit Sekundärantikörper (siehe Tabelle der Materialien) verdünnt 1:200 in Antikörpern Verdünnungslösung.HINWEIS: Zellkerne können gleichzeitig gebeizt werden, indem der gleichen sekundären Antikörperlösung 0,5 g/ml 4′,6′-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) hinzugefügt werden. Inkubieren Sie die Zellen für 1 h bei 37 °C im Dunkeln. Andere sekundäre Antikörper, die mit anderen Fluorophoren konjugiert sind, können verwendet werden. Entfernen Sie den sekundären Antikörper und DAPI aus Schritt 3.1.8, waschen Sie die Zellen dreimal mit 1x PBS. Nach dem Waschen die Zellen in 0,25 ml/Gut von 1x PBS lassen. Platzieren Sie die Platte auf der Bühne eines Fluoreszenzmikroskops, um die Expression von Venus- und Nluc-Reportern und NP von infizierten Zellen mit den richtigen Fluoreszenzfiltern zu erkennen. Erfassen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop (20-fache Vergrößerung) und verschmelzen Sie sie mit einer Bildbearbeitungssoftware (Abbildung 2A,B). Analysieren Sie die Nluc-Aktivität (Abbildung 2C) und die Virusreplikation (Abbildung 2D). Einen Tag vor der Infektion säen 12-Well-Platten mit MDCK-Zellen (2 x 105Zellen/well, Triplicate) mit Gewebekulturmedien in einem 37 °C-Inkubator mit 5% CO2, um bis zur Infektion etwa 90% Konfluenz zu erreichen.HINWEIS: Überprüfen Sie vor der Infektion die Zellen unter dem Mikroskop, um eine Monoschicht von MDCK-Zellen zu überprüfen. Der Infektionstag bereitet Verdünnungen der WT- und BIRFLU-Viren in Infektionsmedien vor, um die MDCK-Zellen (Schritt 3.2.1.) in Dreifache mit einem MOI von 0,001 PFU in 0,5 ml/Well zu infizieren. Entfernen Sie das Gewebekulturmedium und waschen Sie die MDCK-Zellen zweimal mit 1x PBS. Fügen Sie die Virusverdünnungen zu den MDCK-Monolayern hinzu und ermöglichen Sie eine virale Adsorption bei Raumtemperatur für 1 h auf einer Schaukelplattform. Nach der viralen Adsorption entfernen Sie das Virus Inokulum und fügen Sie jedem Brunnen 1,5 ml Nachinfektionsmedien hinzu, die 1 g/ml TPCK-behandeltes Trypsin enthalten. Inkubieren Sie infizierte Zellen in einem 5% CO2 befeuchteten Inkubator bei 33 °C und sammeln Überstand zu den in Schritt 3.2.4 angegebenen Zeitpunkten. Bei 24, 48, 72 und 96 h nach der Infektion (p.i.) sammeln 150 L Gewebekultur-Überstand aus jedem Brunnen und speichern die Proben in einem Mikrozentrifugenrohr bei -80 °C, um die Nluc-Assays und viralen Titrationen durchzuführen. Um den Nluc-Aktivitätstest durchzuführen, folgen Sie den Angaben des Herstellers. Zuerst tauen Sie den bei -80 °C (Schritt 3.2.4) gelagerten Gewebekulturüberstand auf Eis auf.HINWEIS: Beziehen Sie sich auf die Empfehlungen des Herstellers und optimieren Sie den Test bei Bedarf. Bereiten Sie die Luziferase-Assay-Lösung (siehe Materialtabelle) vor, indem Sie das Nluc-Substrat 1:50 mit dem Verdünnungspuffer verdünnen. Mischen Sie in einer weißen 96-Well-Mikroplatte mit flachem Boden für Luziferase-Assays 25 L Luziferase-Assay-Lösung mit 10 bis 25 l der gesammelten Gewebekultur-Überstandproben. Inkubieren Sie die Mischung für 2-3 min, bevor Sie die Lumineszenz mit einem Luminometer messen (Abbildung 2C).HINWEIS: Das Vorhandensein infektiöser Viruspartikel in der Gewebekultur wird durch Fluoreszenz-Immunfokus-Assay (Venus) oder indirekte Immunfluoreszenz (virale Antigenfärbung) wie zuvor beschrieben23,32, 33,56. Einen Tag vor viralen Titrationen samen MDCK-Zellen in einer 96-Well-Platte (2 x 104 Zellen/well, Triplicate) mit Gewebekulturmedien und ermöglichen es Zellen, bis zur Infektion in einem Inkubator, der bei 37 °C bei 5% CO2 liegt, 90% Zusammenfluss zu erreichen. Verwenden Sie die Gewebekultur-Überstandproben, die auf Eis aufgetaut wurden (Schritt 3.2.4.). Fügen Sie in jeder der Brunnen in einer neuen 96-Well-Platte 90 L Infektionsmedien hinzu, und fügen Sie dann 10 L des aufgetauten Gewebekulturüberstandes (Schritt 3.2.4) zum ersten Brunnen (Zeile A) hinzu. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipetten, um 10 l von Zeile A in Zeile B zu mischen und zu übertragen. Ändern Sie die Spitzen zwischen Verdünnungen und mischen Sie sie gut.HINWEIS: Dieser Vorgang sollte bis zur letzten Zeile (H) wiederholt werden. Wir empfehlen die Durchführung viraler Titrationen in Triplicaten zur genauen Messung von viralen Tittern. Entfernen Sie das Gewebekulturmedium aus den MDCK-Zellen in den 96-Well-Platten (Schritt 3.2.7) und waschen Sie es zweimal mit 1x PBS. Fügen Sie 50 l der überstandenen Verdünnungen der Replik96-Well-Platte, die die Virusverdünnungen (Schritt 3.2.8) enthält, zu jedem Brunnen in der 96-Well-Platte, die MDCK-Zellen enthält. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte auf einer Schaukelplattform für 1 h bei Raumtemperatur, um eine virale Adsorption zu ermöglichen. Nach der viralen Adsorption entfernen Sie das Inokulum und fügen Sie 100 L/Well von Nachinfektionsmedien hinzu, die 1 g/ml TPCK-behandeltes Trypsin enthalten. Inkubieren Sie infizierte Zellen für 12 h in einem33 °C Inkubator mit 5% CO2 . Da BIRFLU Venus ausdrückt, kann die Anzahl der infizierten Zellen direkt mit einem Fluoreszenzmikroskop gezählt werden. Alternativ können virale Titter durch indirekte Immunfluoreszenz bestimmt werden, wie zuvor mit einem Antikörper gegen ein virales Protein23,56,57,59beschrieben. Für letztere, fahren Sie fort, die Zellen zu fixieren/permeabilisieren und mit dem Anti-NP mAb HB-65, wie in Abschnitt 4.4 beschrieben, zu befestigen/permeabilisieren. Bestimmen Sie die viralen Titer, indem Sie die Anzahl der fluoreszierenden Einheiten (FFU)/ml nach der Formel zählen: ((Anzahl der FFU) x 20 x 1/Verdünnung (Abbildung 2D). 4. In-Vivo-Charakterisierung von BIRFLU (Abbildung 3 und Abbildung 4) MausinfektionHINWEIS: Intranasale Infektion von Mäusen wurde wie zuvor beschrieben23durchgeführt. Für ein detaillierteres Protokoll der IAV-Infektion in vivo mit dem Mausmodell der Infektion, empfehlen wir das Video mit der vorherigen Publikation23zugeordnet anzeigen. In diesem Abschnitt werden nur die Schritte zusammengefasst, die für eine Mausinfektion mit BIRFLU erforderlich sind. Überprüfen Sie die Mäuse, um ihre Gesundheit und ihr allgemeines körperliches Erscheinungsbild zu bewerten. Bereiten Sie die Verdünnung von BIRFLU in 1x PBS vor, um Mäuse mit 1 x 106 PFU BIRFLU in einem Gesamtvolumen von 30 l/Maus zu impfen. Halten Sie das Virus auf Eis bis zur Mausimpfung.HINWEIS: Mock-infizierte (1x PBS) Mäuse werden als interne Kontrolle für die Bildgebung benötigt. Platzieren Sie mockinfizierte Mäuse in einem anderen Käfig als BIRFLU-infizierte Tiere. Anästhetisieren Sie fünf- bis sieben Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse intraperitoneal mit 240–250 mg/kg Tribromethanol (TBE), indem Sie die Nadel in die kaudale 2/3 der rechten Seite des Bauches einsetzen. Dann kehren Sie die Maus in den Käfig zurück und warten Sie etwa 5 min. Überprüfen Sie, ob die Maus vor der Virusimpfung durch das Fehlen des Zehen-Pinch-Reflexes beäszisiert ist.HINWEIS: Injizierbare Beruhigungsmittel werden bei inhalierten Beruhigungsmitteln für Influenza-Infektionen in vivo empfohlen, da letztere das Verhalten und die Aufnahme des Virus durch das Atemwegsepithel verändern können. Darüber hinaus können sie auch lokale Immunreaktionen der Lunge beeinflussen und die In-vivo-Bildgebung infizierter Mäuse stören. Schließlich haben inhalierte Beruhigungsmittel die Wirkungsdauer verringert, was ein Problem für die In-vivo-Bildgebung der infizierten Tiere wäre. Impfen Sie die Mäuse intranasal mit den 30 l der vorbereiteten BIRFLU-Verdünnung. Überprüfen Sie, ob die Mäuse richtig atmen, bevor Sie sie in den Käfig zurückbringen. Biolumineszenzüberwachung von mit BIRFLU infizierten Mäusen (Abbildung 4A)HINWEIS: In diesem Manuskript werden der Ausdruck von Nluc oder Venus und die Virusreplikation in der Lunge von mit BIRFLU infizierten Mäusen nach 3 Tagen nach der Infektion bestimmt. Die Art der Biolumineszenz-Bildgebung ermöglicht jedoch eine wiederholte Überwachung der Nluc-Expression bei einzelnen BIRFLU-infizierten Tieren, ohne sie für jeden versuchsweise Zeitpunkt einschläfern zu müssen. Für die Durchführung der beschriebenen experimentellen Verfahren ist ein In-vivo-Bildgebungssystem mit einer Isofluran-Anästhesie-Mannifasie erforderlich. Weitere Informationen zum Bildverarbeitungsinstrument und zur Bildsoftware, die für die Bildaufnahme und Datenanalyse verwendet werden, finden Sie in der Tabelle des Materials. Rasieren Sie die Brust der Mäuse, um das Biolumineszenzsignal zu verbessern. Öffnen Sie die Imaging-Software, und drücken Sie Initialize. Legen Sie als Nächstes die parameter fest, die verwendet werden, einschließlich der Einstellung des Bildgebungsmodus auf Biolumineszenz, automatisches Speichern, Belichtungszeit gegenüber Auto, offenem Filter usw. Sobald die Maschine vollständig initialisiert ist, schalten Sie das Isofluran-Anästhesiesystem ein. Tiere in die Anästhesiekammer geben. Mäuse werden gleichzeitig und leicht mit einem Gemisch aus Sauerstoffgas und verdampftem 1-2% Isofluran besäuztiert. Sobald Mäuse anästhesiert sind, verabreichen Sie das Nluc-Substrat (siehe Materialtabelle) verdünnt 1:10 in 1x PBS (Endvolumen 100 l/Maus) über retro-orbitale Route mit einer Spritze mit einer 22 G Nadel. Unmittelbar nach der Verabreichung des Nluc-Reagenzes legen Sie die Tiere in das Bildgebungsinstrument mit nach oben gerichteter Brust und Schnauch in den Mannigfaltigkeitskegel, um die Tieranästhesie während der Bildgebung zu beäugen. Unmittelbar nach dem Schließen der Imagertür klicken Sie im Softwareprogramm auf Acquire (Abbildung 4A, oben). Nach der Bildgebung kehren Sie die Mäuse in ihre Käfige zurück, um sie zu überwachen, bis sie sich vollständig erholt haben, und schalten Sie den Isofluran-Verdampfer aus. Fahren Sie dann mit der Ex-vivo-Bildgebung der Mäuselunge fort, um die Genexpression des Venusreporters zu bewerten (Abschnitt 4.3). Verwenden Sie die Imaging-Software-Tools, um die erfassten Biolumineszenzdaten zu analysieren. Verwenden Sie das Tool ROI (Interessengebiet), um das spezifische Signal zu bestimmen und Flussmessungen im Interessenbereich (in der Regel um die Brust) durchzuführen (Abbildung 4A, unten). Obwohl die ROI-Form irrelevant ist, werden größere ROIs im Allgemeinen bevorzugt, um den gesamten Signaldiffusionsbereich zu erfassen. Klicken Sie auf Messen. Bewerten Sie die Biolumineszenz in Photonen, da sie eine absolute Photonenemissionsmessung bietet, die mit Ausgangsmessungen vergleichbar ist, die von verschiedenen Parametern oder bildgebenden Instrumenten bereitgestellt werden. Fluoreszenzanalyse bei mit BIRFLU infizierten Mäusen (Abbildung 3 und Abbildung 4B) Sammeln Sie die Mauslunge nach in vivo Bildgebung, wie zuvor beschrieben23. Kurz gesagt, einschläfern Mäuse mit einer tödlichen Dosis von TBE (500 mg/kg). Desinfizieren Sie die Einschnittstelle mit 70% Ethanol. Mit einem Skalpell einen Schnitt vom Brustbein bis zur Unterseite des Bauches machen und dann von der Unterseite des Schnittes mit einer Schere von der Unterseite des Schnittes zu den Seiten schneiden. Als nächstes schneiden Sie die Lebervene (zweite physikalische Euthanasie-Methode), um das Tier zu bluten.HINWEIS: Um ein hohes Hintergrundsignal während der Bildgebung zu vermeiden, ist es wichtig, die Blutmenge in der Lunge zu minimieren (siehe unten). Legen Sie die Maus in dorsale Recumbency, und verwenden Sie die Schere, um die Pleura zu schneiden und öffnen Sie den Rippenkäfig. Anschließend entfernen Sie die Lunge, indem Sie das Ende der Luftröhre mit einer Schere schnipsen, während Sie die Lunge vorsichtig mit Zangen halten. Legen Sie die Lunge in eine Sechs-Brunnen-Platte mit 2 ml 1x 1x PBS und waschen Sie die Lunge dreimal mit 1x PBS.HINWEIS: Um eine Kontamination zwischen den Proben zu vermeiden, reinigen und desinfizieren Sie die Zersebungswerkzeuge zwischen den einzelnen Tieren. Starten Sie die Bildaufnahmesoftware, indem Sie auf Initialisierung klicken und die Parameter für die Bildgebung festlegen, einschließlich der Einstellung des Bildgebungsmodus auf Fluoreszenz, automatische einsparen, Die Belichtungszeit gegenüber Auto, Anregung (500 nm) und Emissionsfilter (540 nm). Wenn die Maschine initialisiert wird, legen Sie die Lunge in ein schwarzes Hintergrundtablett, um sicherzustellen, dass die Gewebe voneinander getrennt sind, führen Sie das Fach in die Bildmaschine ein, und klicken Sie auf Bildverarbeitungssystemprogramm nach dem Schließen der Bildtür ( Abbildung 4B, oben). Nach der Bildgebung die Gewebe sofort entfernen und auf Eis (4 °C) lagern, wenn die Proben noch am selben Tag verarbeitet werden; oder auf einem Rohr und Trockeneis, um sie schnell einzufrieren, bevor sie bei -80 °C gelagert werden, wenn die Proben später an einem anderen Tag verarbeitet werden. Wählen Sie für die Bildverarbeitung das ROI-Tool aus und zeichnen ROIs um jede einzelne Lunge. Klicken Sie auf Messen. Subtrahieren Sie dann anhand der resultierenden durchschnittlichen Strahlungseffizienzmessungen die Werte von den mit Mock infizierten Mäusen (Abbildung4B, unten).HINWEIS: Mit BIRFLU gibt es eine gute Korrelation der Konzentrationen des Nluc- und Venus-Ausdrucks und der Signalverteilung. Daher ist es wichtig, den Nluc-Ausdruck (ganze Maus) und Venus (excised lungs) aus demselben Tier zu analysieren und die gleiche Ausrichtung beizubehalten. Auswertung der BIRFLU-Replikation in der Mäuselunge (Abbildung 3 und Abbildung 4C) Homogenisieren Sie die Lungen von Mäusen für die virale Titration durch Plaque-Assay wie zuvor beschrieben23. Legen Sie die Lunge in einen Dounce Homogenisator mit 1 ml gekühlten Infektionsmedien. Homogenisieren Sie die Lunge mit dem Stößel für 1 min bei Raumtemperatur, bis es vollständig zerfallen ist und lagern Sie die Proben in einem sterilen Rohr bei 4 °C. Zentrifugieren Sie die Proben bei 300 x g für 10 min und sammeln Sie den Überstand in einem sterilen Rohr. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf, wenn sie am selben Tag verwendet werden, oder frieren Sie sie bei -80 °C ein, um virale Titer zu einem späteren Zeitpunkt zu bewerten.HINWEIS: Für jede Lungenprobe sollte ein neuer Dounce Homogenisator verwendet werden. Um den Plaque-Assay durchzuführen, am Tag vor der Durchführung der viralen Titration, Samen sechs-Well-Platten mit MDCK-Zellen (5 x 105 Zellen/gut) in Gewebekultur-Medien. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C mit 5% CO2, um am nächsten Tag 90% Zusammenfluss zu erreichen. Bestätigen Sie vor der Infektion, dass die Zellen eine Monoschicht unter einem Lichtmikroskop bilden. 1:10 serielle Verdünnungen des Überstandes aus den homogenisierten Proben (Schritt 4.4.1) in Infektionsmedien vorbereiten. Bereiten Sie Mikrozentrifugenröhrchen mit 540 l Infektionsmedien vor, fügen Sie 60 l aus der homogenisierten Lungenprobe in das erste Röhrchen, mischen Sie sie durch Pipettieren nach oben und unten, und übertragen Sie dann mit einer neuen Spitze 60 l in das nächste Rohr. Wiederholen Sie diesen seriellen Verdünnungsprozess bis zur letzten Verdünnung.HINWEIS: Nach unserer Erfahrung reichen 7 Verdünnungen aus, um virale Titter durch Plaque-Assay aus der Lunge infizierter Mäuse zu bestimmen. Waschen Sie die MDCK-Zellen (Schritt 4.4.3) zweimal mit 1x PBS und übertragen Sie 500 l der seriell verdünnten Proben auf jeden Brunnen in der Sechs-Well-Platte. Legen Sie die Platten auf eine Schaukelplattform und ermöglichen virale Absorption für 1 h bei Raumtemperatur auftreten. Nach 1 h virusischer Absorption das virale Inokulum entfernen, 2 ml/Well des Overlay-Mediums mit 1 g/ml TPCK-behandeltem Trypsin hinzufügen und dann die Zellen 3 Tage lang bei 33 °C unter 5% CO2 inkubieren. Fix infizierte Zellen (Schritt 4.4.6) mit 1 ml/Gut von 4% Formaldehyd in 1x PBS bei Raumtemperatur für 2 h verdünnt, dann vorsichtig entfernen Sie das Overlay-Medium und fügen Sie 1 ml 1x PBS zu jedem Brunnen. Zur Visualisierung der Venus, bilden Sie die Sechs-Well-Platten mit einem Bildgebungssystem zur Detektion von Fluoreszenz.HINWEIS: Virale Plaques können mit einer Bildbearbeitungssoftware eingefärbt werden (siehe Tabelle der Materialien). Um die Nluc-Expression zu bewerten, visualisieren Sie virale Plaques durch Immunfärbung mit einem Anti-Nluc pAb. Entfernen Sie dazu die 1x PBS, permeabilisieren Zellen mit 0,5 ml/Well der Permeabilisationslösung für 15 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Permeabilisationslösung, waschen Sie die Zellen dreimal mit 1x PBS und blockieren Sie mit 0,5 ml/Gut der Blockierlösung für 1 h bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Blockierlösung aus Schritt 4.4.9 und inkubieren Sie die Zellen mit 0,5 ml/Well des pAb anti-Nluc verdünnt 1:1.000 in Verdünnungslösung für 1 h bei 37 °C. Verwenden Sie ABC Alkaline Phosphatase Kit und DAB Peroxidase Substrate Kit nach der Empfehlung des Herstellers für die Visualisierung von Nluc-expressing Plaques. Kurz gesagt, waschen Sie Zellen ab 4.4.10 dreimal mit 1x PBS und inkubieren Sie sie mit 0,5 ml/Well von biotinylierten Anti-Kaninchen-Sekundärantikörpern für 1 h bei 37 °C. Entfernen Sie den sekundären Antikörper, waschen Sie die Zellen dreimal mit 1x PBS und brüten Sie mit der ABC-Lösung für 1 h bei 37 °C. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 1x PBS und visualisieren Sie die viralen Plaques mit dem DAB HRP Substrat Kit. Scannen Sie die immunbefleckten Plaques mit einem herkömmlichen Scanner.HINWEIS: Andere ähnliche Kits für die Immunfärbung könnten verwendet werden. Die viralen Plaques mit kristallvioletter Lösung für 1 h bei Raumtemperatur färben. Entsorgen Sie das Kristallviolett, waschen Sie die Platten dreimal mit Wasser, lassen Sie die Platten trocknen und scannen Sie die Platten erneut. Um virale Titer zu bestimmen, zählen Sie die Plaques, die nach der kristallvioletten Färbung aufgedeckt wurden. Scannen Sie die Plaques mit einem herkömmlichen Scanner. Berechnen Sie Virustiter als Plaque-Bildeinheiten (PFU) pro ml (PFU/ml). Um die BIRFLU-Stabilität in vivo zu bewerten, berechnen Sie den Prozentsatz der Reporter-exezierenden Viren, indem Sie die Anzahl der kristallviolett gefärbten Plaques (Anzahl der infektiösen Viren, Schritt 4.4.12) zählen und mit der Anzahl der Venus- und Nluc-exezierenden Plaques vergleichen ( Schritt 4.4.7 bzw. Schritt 4.4.11).