Canlı Görüntüleme ve Viral Enfeksiyon Quantification için Bir Luciferase-floresan Reporter Grip Virüsü

Farelerle ilgili tüm protokoller, Rochester Üniversitesi Tıp ve Diş Hekimliği Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) tarafından onaylanmıştır. Hayvanlarda yapılan tüm deneyler, Ulusal Araştırma Konseyi58Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu’ndaki tavsiyelere uyun. Rochester Üniversitesi Tıp ve Diş Hekimliği Fakültesi’ndeki Laboratuvar Hayvan Tıbbı tesislerinin Vivarium ve Bölümü, Laboratuvar Hayvan Bakımı (AALAC) Uluslararası Ve federal ve eyalet yasalarına ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) politikasına uymak. Farelerle çalışırken uygun Kişisel Koruma Ekipmanları (PPE) gereklidir. Her kurumda bu makalede özetlenen deneyler icra edilirken benzer politikalar ve gereksinimler uygulanmalıdır. 1. Küçük Omurgalı Hayvanların Kullanımı Beş ila yedi haftalık dişi BALB/c farelerini satın alın ve özel patojensiz koşullar altında hayvan bakım tesisinde muhafaza edin. Fareler belirlenen tesislere vardıklarında, hayvanların yeni ortamlarına uyum sağlaması için 4-5 gün dinlenme süresi bekleyin. IACUC protokollerini izleyerek, kafes başına en fazla 5 fare yerleştirin.NOT: Deney sonucunda, hayvanın öldüğünden emin olmak için, fareler ikincisinin fiziksel bir yöntem olması gerektiği göz önünde bulundurularak onaylanan iki prosedür kullanılarak ötenaziye tabi tutulmaktadır. Bu çalışmada, BIRFLU ve in vivo görüntüleme ile fare enfeksiyonu sonra, hayvanlar öldürücü bir doz ile ötenazi edilir 2,2,2-tribromoetanol (TBE), ve daha önce gösterdiğimiz gibi fiziksel ikincil yöntem olarak hepatik ven keserek23. 2. Biyogüvenlik NOT: Bu yazıda, BIRFLU influenza A/ Porto Riko/08/34 H1N1 (PR8), ortak bir fare uyarlanmış laboratuvar IAV suşu23,32,33,56omurgasında oluşturuldu . Virüs daha önce açıklanan plazmid tabanlı ters genetik yaklaşımlar ve nesil tam bir açıklama kullanılarak oluşturuldu ve in vitro ve BIRFLU in vivo karakterizasyonu bizim son yayınbulunabilir 55. IAV enfeksiyonlarını içeren tüm işlemler (in vitro veya in vivo) biyolojik güvenlik kabininde biyogüvenlik düzeyi (BSL)-2 koşulları altında gerçekleştirildi. DİkKAT: Uygun bir biyogüvenlik düzeyi biyogüvenlik risk değerlendirmesine uygun olarak belirlenmelidir. Biyogüvenlik risk değerlendirmelerinin yapılması ve etkili biyogüvenlik içeren bir alan oluşturulması na ilişkin ek bilgiler, deneylerin yapılacağı kuruma danışılmalıdır. Biyogüvenlik dolaplarını tüm deneysel işlemlerden önce ve sonra etanol veya klor dioksit dezenfektanile temizleyin. Fareler için, tüm diseksiyon malzemelerini (makas, diseksiyon forsepsi, vb.) ve dounce homogenizer’ı kullanımdan önce ve sonra sterilize edin. Prosedürler sırasında üretilen tüm biyolojik materyalleri uygun IBC ve IACUC yönergeleri altında atın. 3. BirFLU’nun In Vitro Karakterizasyonu (Şekil 2) NOT: Tüm arabellek ve ortam kompozisyonları için Tablo 1’e bakın. Protein ekspresyonunu floresans (Şekil2A) ve dolaylı immünfloresans ile analiz edin (Şekil 2B) Enfeksiyondan bir gün önce, madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epitel hücreleri (1 x 105 hücre/kuyu, triplicates) ile tohum 24-iyi plakalar doku kültürü medya ve% 5 CO2ile 37 ° C kuvöz plakaları korumak . Hem mock-enfekte hem de BIRFLU enfekte hücrelerde seçilen tüm antikorları değerlendirmek için yeterli kuyu hazırlayın.NOT: Viral enfeksiyona başlamadan önce bir monolayer onaylamak için bir ışık mikroskop altında hücreleri görselleştirme öneririz. MdCK hücrelerinin enfeksiyon zamanına kadar birleşmesi önerilir. Enfeksiyon medyasında WT veya BIRFLU IV’lerin seyreltmelerini hazırlayın ve 0,25 mL/well enfeksiyon ortamının son hacminde hücre başına 0,1 plak oluşturan birim (PFU) çokluğu ile tohumlu MDCK hücrelerine bulaştırın. Doku kültürü ortamını adım 3.1.1’den çıkarın ve MDCK hücrelerini 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkayın. 3.1.2’den MDCK hücrelerine virüs seyreltmelerini ekleyin ve plakaları viral adsorpsiyona izin vermek için oda sıcaklığında 1 saat boyunca sallanan bir platforma yerleştirin.NOT: Sahte enfekte hücreler virüs yokluğunda sadece enfeksiyon media ile kuluçkaya yatırılır. Viral adsorpsiyondan sonra (adım 3.1.3), aspirasyon ile viral inokülü çıkarın ve her kuyuya 1 μg/mL TPCK ile tedavi edilen tripsin içeren 1 mL enfeksiyon sonrası ortam ekleyin. 33 °C’de %5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 18 saat kuluçka hücreleri. 18 saat enfeksiyon dan sonra, 24-iyi plakalar (3.1.4) doku kültürü supernatant kaldırın. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 0,25 mL/kuyu fiksasyon/permeabilizasyon çözeltisi ile hücreleri sabitleyip permeabilize edin.NOT: Formaldehit maruziyetini önlemek için fiksasyon/permeabilizasyon çözeltisini duman kaputunda hazırlayın. Fiksasyon/permeabilizasyon çözümünün 3.1.5 adımından çıkarın, hücreleri 1x PBS ile iki kez yıkayın ve hücreleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca 0,25 mL/kuyuile katıştırın.NOT: Bir sonraki adıma geçin veya hücreleri bir gecede 4 °C’de tıkama çözümünde depolayın. Engelleme çözeltisini (adım 3.1.6) çıkarın ve Fare monoklonal antikorunun (MAb) IAV nükleoproteinine, NP’ye (HB-65) veya NLuc’a karşı 1:1.000’lik bir tavşan poliklonal antikorunun (pAb) seyreltilmesine karşı 0,25 mL/iyi (1 μg/mL) ekleyin (Malzeme Tablosunabakınız). her ikisi de antikor seyreltme çözeltisi (1x PBS, %2.5 BSA) seyreltilmiş ve hücreleri 37 °C’de 1 saat kuluçkaya yatırır. 3.1.7 adımdan birincil antikor çıkarın, hücreleri 1x PBS ile üç kez yıkayın ve 0.25 mL/well ile inkübed texas kırmızı konjuge anti-fare veya anti-tavşan ikincil antikorlar (Malzemeler Tablosubakınız) antikor 1:200 seyreltilmiş seyreltme çözeltisi.NOT: Hücre çekirdekleri aynı sekonder antikor çözeltisine 0.5 μg/mL 4′,6′-diamidino-2-fenilindole (DAPI) eklenerek aynı anda elde edilebilir. Hücreleri karanlıkta 37 °C’de 1 saat kuluçkaya yatırın. Diğer floroforlarla konjuge diğer sekonder antikorlar kullanılabilir. İkincil antikor ve DAPI’yi adım 3.1.8’den çıkarın, hücreleri 1x PBS ile üç kez yıkayın. Yıkadıktan sonra hücreleri 0,25 mL/kuyuda 1x PBS’de bırakın. Venüs ve Nluc muhabiri ifadesini tespit etmek için plakayı floresan mikroskobun sahnesine, uygun floresan filtreleri kullanarak enfekte hücrelerden np’yi yerleştirin. Floresan mikroskobu (20x büyütme) kullanarak görüntüleri yakalayın ve bir görüntü düzenleme yazılımı (Şekil2A,B)kullanarak birleştirin. Nluc aktivitesini(Şekil 2C)ve viral replikasyonu (Şekil2D)analiz edin. Enfeksiyondan bir gün önce, MDCK hücrelerine sahip 12 kuyulu tabaklar (2 x 105hücre/kuyu, triplicates) 37 °C’lik bir kuluçka makinesinde %5 CO2 ile doku kültürü ortamını kullanarak enfeksiyon zamanına kadar yaklaşık biraraya gelir.NOT: Enfeksiyondan önce, MDCK hücrelerinin monotabakasını doğrulamak için mikroskop altındaki hücreleri kontrol edin. Enfeksiyon günü, 0,5 mL/kuyuda 0.001 PFU moi ile trilikite olarak MDCK hücrelerine (adım 3.2.1.) bulaşmasını sağlamak için enfeksiyon ortamlarında WT ve BIRFLU virüslerinin seyreltilmesini hazırlar. Doku kültürünü orta çıkarın ve 1x PBS ile iki kez MDCK hücreleri yıkayın. MDCK monolayers virüs seyreltme ekleyin ve bir sallanan platformda 1 saat oda sıcaklığında viral adsorpsiyon sağlar. Viral adsorpsiyondan sonra, virüs inoculumunu çıkarın ve her kuyuya 1 μg/mL TPCK ile tedavi edilen tripsin içeren 1,5 mL enfeksiyon sonrası ortam ekleyin. Enfekte hücreleri 33 °C’de %5 CO2 nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın ve 3.2.4 adımda belirtilen zaman noktalarında süpernatants toplayın. 24, 48, 72 ve 96 h post enfeksiyon (p.i.) her kuyudan 150 μL doku kültürü supernatant toplamak ve Nluc tahlilleri ve viral titrasyonlar gerçekleştirmek için -80 °C’de bir mikrosantrifüj tüpü nde örnekleri saklayın. Nluc etkinlik tayini gerçekleştirmek için üreticinin göstergelerini takip edin. İlk olarak, -80 °C ‘de (adım 3.2.4) buz üzerinde depolanan doku kültürü supernatant çözülür.NOT: Üreticinin önerilerine bakın ve gerekirse türetiyi optimize edin. Luc substrat 1:50’yi seyreltme tamponuyla seyrelterek luciferase tsay çözeltisini (Bkz. MalzemelerTablosuna bakın) hazırlayın. Luciferase tahlilleri için beyaz düz alt 96-iyi mikroplaka, toplanan doku kültürü supernatant örnekleri 10 ila 25 μL ile luciferase tahlil çözeltisi 25 μL karıştırın. Bir luminometre (Şekil2C)kullanarak lüminesans ölçmeden önce karışımı 2-3 dakika kuluçkaya yatırın.NOT: Doku kültürü supernatants enfeksiyöz viral parçacıkların varlığı floresan bağışıklık odaklama analizi tarafından belirlenir (Venüs) veya dolaylı immünfloresans (viral antijen boyama) daha önce açıklandığı gibi23,32, 33,56. Viral titrasyonlardan bir gün önce, doku kültürü ortamları ile 96 kuyulu bir plakadaki (2 x 104 hücre/kuyu, üçleme) tohum MDCK hücreleri ve hücrelerin enfeksiyon zamanında birleşmesine izin vererek %5 CO2ile 37 °C’de bir kuvözde yer alabilebiledir. Buzüzerinde çözülmüş doku kültürü supernatant örneklerini kullanın (adım 3.2.4.). Yeni bir 96-iyi plaka kuyuların her birine enfeksiyon medya 90 μL ekleyin, sonra ilk kuyu (satır A) için çözülmüş doku kültürü supernatant (adım 3.2.4) 10 μL ekleyin. A satırından B satırına 10 μL’yi karıştırmak ve aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın.NOT: Bu yordam son satıra (H) kadar tekrarlanmalıdır. Biz viral titrelerin doğru ölçmek için triplicates viral titrasyonlar gerçekleştirmenizi öneririz. 96 kuyuplakalarında (adım 3.2.7) MDCK hücrelerinden doku kültürü ortamını çıkarın ve 1x PBS ile iki kez yıkayın. MDCK hücreleri içeren 96 kuyulu plakadaki her kuyuya virüs seyreltmelerini (adım 3.2.8) içeren 96 kuyulu plakanın süpernatant seyreltmelerinin 50’sini ekleyin. Viral adsorpsiyon sağlamak için oda sıcaklığında 1 saat için sallanan bir platform üzerinde 96-iyi plaka kuluçka. Viral adsorpsiyondan sonra inokülü çıkarın ve 1 μg/mL TPCK ile tedavi edilen tripsin içeren enfeksiyon sonrası ortama 100 μL/kuyu ekleyin. Enfekte hücreleri %5 CO2ile 33 °C’lik bir kuluçka makinesinde 12 saat kuluçkaya yatırın. BIRFLU Venüs ifade yana, enfekte hücrelerin sayısı doğrudan bir floresan mikroskop kullanılarak sayılabilir. Alternatif olarak, viral titreler daha önce viral bir protein23,56,57,59karşı bir antikor kullanılarak açıklandığı gibi dolaylı immünoresans tarafından tespit edilebilir. İkincisi için, bölüm 4.4’te açıklandığı gibi anti-NP mAb HB-65 kullanarak hücreleri ve lekeyi düzeltmeye/permeabilize etmeye devam edin. Formülü kullanarak floresan oluşturan birimlerin (FFU)/mL sayısını sayarak viral titreleri belirleyin: ((FFU sayısı) x 20 x 1/seyreltme (Şekil 2D). 4. BirFLU’nun Vivo Karakterizasyonunda (Şekil 3 ve Şekil 4) Fare enfeksiyonuNOT: Farelerin intranazal enfeksiyonu daha önce açıklandığı gibi yapıldı23. İnfeksiyon fare modelini kullanarak in vivo IAV enfeksiyonu daha ayrıntılı bir protokol için, önceki yayın23ile ilişkili video görüntülemenizi öneririz. Bu bölümde yalnızca BIRFLU ile fare bulaşması için gereken adımları özetler. Sağlıklarını ve genel fiziksel görünümlerini değerlendirmek için fareleri inceleyin. 1x PBS’deki BIRFLU seyreltmesini, toplam 30 μL/fare hacminde 1 x 106 PFU ile fareleri aşılamaya hazırlayın. Fare aşısı olana kadar virüsü buzda koruyun.NOT: Mock-infected (1x PBS) fareler görüntüleme için iç kontrol olarak gerekli olacaktır. Birflu-enfekte hayvanlardan farklı bir kafese sahte enfekte fareler yerleştirin. Beş ila yedi haftalık dişi BALB/c fareleri intraperitoneal olarak 240-250 mg/kg tribromoetanol (TBE) ile anesteze ederek iğneyi karın sağ tarafının 2/3’üne sokun. Daha sonra fareyi kafese geri döndürün ve yaklaşık 5 dakika bekleyin.NOT: Enjektabl yatıştırıcılar in vivo grip enfeksiyonları için inhale yatıştırıcılar üzerinde tavsiye edilir, ikincisi hava yolu epitel tarafından davranış ve virüs alımını değiştirebilirsiniz gibi. Ayrıca, onlar da akciğer lokal bağışıklık yanıtlarını etkileyebilir ve enfekte farelerin in vivo görüntüleme ile müdahale. Son olarak, inhale yatıştırıcılar etki süresini azalttı, hangi enfekte hayvanların in vivo görüntüleme için bir sorun olacaktır. Hazırlanan BIRFLU seyreltme 30 μL ile fareler intranasialınaşılamak. Farelerin kafese geri dönmeden önce düzgün nefes alıp vermediğini kontrol edin. BIRFLU ile enfekte farelerin biyolüminesans takibi (Şekil 4A)NOT: Bu el yazmasında Nluc veya Venüs’ün ifadesi ve BIRFLU ile enfekte olmuş farelerin akciğerlerindeki viral çoğalması enfeksiyon sonrası 3 gün olarak belirlenmiştir. Ancak, biyolüminesans görüntüleme doğası her deneysel zaman noktası için onları ötenazi gerek kalmadan bireysel BIRFLU enfekte hayvanlarda Nluc ifade nin tekrartekrar izlenmesine olanak sağlar. Açıklanan deneysel işlemlerin yapılabilmesi için isofluran anestezi manifoldu olan in vivo görüntüleme sistemi gereklidir. Görüntü toplama ve veri analizi için kullanılan görüntüleme aracı ve görüntü yazılımı ile ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. Biyolüminesans sinyalini iyileştirmek için fare lerin göğsünü tıraş edin. Görüntüleme yazılımını açın ve Initializetuşuna basın. Ardından, görüntüleme modunu biyolüminesansa ayarlama, otomatik kaydetme, otomatik, açık filtre, vb. için maruz kalma süresi dahil olmak üzere kullanılacak parametreleri ayarlayın. Makine tamamen başharfe döndükten sonra, isofluran anestezi sistemini açın. Hayvanları anestezi odasına yerleştirin. Fareler aynı anda ve hafifçe oksijen gazı karışımı ile anestezi ve buharlaşmış 1-2% isoflurane. Fareler anestezi edildikten sonra, 22 G iğneli bir şırınga kullanarak retro-orbital rota üzerinden 1x PBS’de (son hacim 100 μL/fare) 1:10 seyreltilmiş Nluc substratını (Malzeme Tablosuna bakın) uygulayın. Nluc reaktif uygulamasından hemen sonra, hayvanları görüntüleme sırasında anestezi altında tutmak için, hayvanları göğüslerini yukarı bakacak şekilde ve manifold konisinin içine sokarak görüntüleme aletine yerleştirin. Görüntüleyici kapısını kapattıktan hemen sonra, yazılım programında Edinme’yi tıklatın (Şekil4A, üst). Görüntülemeden sonra, fareleri tamamen iyileşene kadar onları izleyen kafeslerine geri verin ve izofluran buharlaştırıcıyı kapatın. Daha sonra, Venüs muhabiri gen ekspresyonunu değerlendirmek için fare akciğerlerinin ex vivo görüntülemesine devam edin (bölüm 4.3). Edinilen biyolüminesans verilerini analiz etmek için görüntüleme yazılımı araçlarını kullanın. Belirli sinyali belirlemek ve ilgi bölgesinde (genellikle göğüs çevresinde) akı ölçümleri yapmak için RoI (ilgi bölgesi) aracını kullan (Şekil4A, alt). Yatırım getirisi şekli alakasız olsa da, sinyal difüzyon alanının tamamını yakalamak için genellikle daha büyük ROI’lar tercih edilir. Ölçü’yetıklayın. Farklı parametreler veya görüntüleme cihazları tarafından sağlanan çıktı ölçümlerine karşılaştırılabilir mutlak bir foton emisyon ölçümü sağladığından, fotonlarda biyolüminesansı değerlendirin. BirFLU ile enfekte farelerde floresan analizi (Şekil 3 ve Şekil 4B) Daha önce açıklandığı gibi, in vivo görüntüleme sonra fare akciğerleri toplamak23. Kısaca, tbe öldürücü bir doz (500 mg / kg) ile fareler ötenazi. Kesi bölgesini etanol ile dezenfekte edin. Bir neşter ile, göğüs göğüs karnından karın tabanına bir kesi yapmak ve daha sonra makas ile yanlara kesi altından kesti. Daha sonra, karaciğer damarı (ikinci fiziksel ötenazi yöntemi) hayvan kanamak için kesti.NOT: Görüntüleme sırasında yüksek arka plan sinyali önlemek için, akciğerlerde kan miktarını en aza indirmek için önemlidir (aşağıya bakın). Dorsal recumbency fare yerleştirin ve plevra kesmek ve göğüs kafesi açmak için makas kullanın. Daha sonra, yavaşça forceps ile akciğerleri tutarak ise makas ile nefes borusu ucunu keserek akciğerleri çıkarın. 1x PBS 2 mL ile altı iyi plaka akciğerler yerleştirin ve 1x PBS ile akciğerleri üç kez yıkayın.NOT: Numuneler arasında kontaminasyonu önlemek için, her hayvan arasındaki diseksiyon araçlarını temizleyin ve dezenfekte edin. Görüntü edinme yazılımını başlatın ve görüntüleme modunu floresan, otomatik kaydetme, otomatik otomatik pozlama süresi, uyarma (500 nm) ve emisyon (540 nm) filtrelerine ayarlama dahil olmak üzere görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Makine başlatıldığında, akciğerleri siyah bir arka plan tepsisine yerleştirin, dokuların birbirinden ayrılmasını sağlar, tepsiyi görüntüleyiciye tanıyın ve görüntüleyici kapısını kapattıktan sonra görüntüleme sistemi programında Edinme’yi tıklatın ( Şekil 4B, üst). Görüntülemeden sonra, numuneler aynı gün işlenirse, dokuları derhal çıkarın ve buzda (4 °C) saklayın; veya numuneler daha sonra farklı bir gün işlenirse, -80 °C’de saklamadan önce, hızlı bir şekilde dondurmak için bir tüp ve kuru buz üzerinde. Görüntü işleme için YG aracını seçin ve her bir akciğerin etrafına ROI çizin. Ölçü’yetıklayın. Daha sonra, elde edilen ortalama radyant verimlilik ölçümlerini kullanarak, sahte enfekte farelerden (Şekil4B, alt) değerleri çıkarın.NOT: BirFLU ile Nluc ve Venüs ekspresyonu düzeyleri ile sinyal dağılımı nın iyi bir korelasyonu vardır. Bu nedenle, aynı hayvanın Nluc (bütün fare) ve Venüs (excised lungs) ifadesini analiz etmek ve aynı oryantasyonu korumak önemlidir. Fare akciğerlerinde BIRFLU replikasyonunun değerlendirilmesi (Şekil 3 ve Şekil 4C) Daha önce açıklandığı gibi plak tahtına viral titrasyon için fare akciğerleri homojenize23. Soğutulmuş enfeksiyon ortamı 1 mL ile bir Dounce homogenizer içine akciğerler yerleştirin. Tamamen parçalanana kadar oda sıcaklığında 1 dakika boyunca havanele ile akciğerleri homojenize ve 4 °C’de steril bir tüpte saklayın. Numuneleri 10 dk için 300 x g’de santrifüj edin ve süpernatant’ı steril bir tüpte toplayın. Aynı gün kullanılacaksa numuneleri buzüzerinde saklayın veya daha sonra viral titreleri değerlendirmek için -80 °C’de dondurun.NOT: Her akciğer örneği için yeni bir Dounce homogenizer kullanılmalıdır. Plak tahsinini gerçekleştirmek için, viral titrasyonun bir gün önce doku kültürü ortamlarında MDCK hücreleri (5 x 105 hücre/kuyu) içeren altı kuyulu tabaklar tohumlar. Hücreleri bir gecede 37 °C’de %5 CO2 ile tüpaltında geçirin ve ertesi gün biraraya ulaşın. Enfeksiyondan önce, hücrelerin ışık mikroskobu altında bir monolayer oluşturduğunu doğrulayın. Enfeksiyon ortamlarında homojenize örneklerden (adım 4.4.1) süpernatantın 1:10 seri seyreltmelerini hazırlayın. 540 μL enfeksiyon ortamına sahip mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın, homojenize edilmiş akciğer örneğinden ilk tüpe 60 μL ekleyin, yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın ve yeni bir uç kullanarak bir sonraki tüpe 60°L aktarın. Bu seri seyreltme işlemini son seyreltme işlemine kadar tekrarlayın.NOT: Bizim deneyim 7 seyreltme enfekte farelerin akciğerlerinden plak tsay ile viral titreleri belirlemek için yeterlidir. MDCK hücrelerini (adım 4.4.3) 1x PBS ile iki kez yıkayın ve seri olarak seyreltilmiş numunelerin 500 μL’sini altı kuyudaki her kuyuya aktarın. Plakaları sallanan bir platforma yerleştirin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca viral emilimin oluşmasını bekleyin. 1 saatlik viral emilimi çıkardıktan sonra, viral inokülü çıkarın, 1 μg/mL TPCK ile tedavi edilen tripsin içeren 2 mL/kuyu bindirme ortamı ekleyin ve hücreleri 3 gün boyunca %5 CO 2’nin altında 33 °C’de kuluçkaya yatırın. Enfekte hücreleri (adım 4.4.6) 1 mL/iyi % 4 formaldehit ile oda sıcaklığında 1x PBS 2 saat boyunca seyreltilmiş, sonra dikkatlice bindirme ortamını çıkarın ve her kuyuya 1 mL 1x PBS ekleyin. Venüs’ün görselleştirilmesi için, altı kuyulu plakaları floresan tespiti için bir görüntüleme sistemiyle görüntüleyin.NOT: Viral plaklar bir görüntü düzenleme yazılımı kullanılarak renklendirilebilir (Bkz. MalzemelerTablosu). Nluc ifadesini değerlendirmek için, bir anti-Nluc pAb kullanarak immünboyama ile viral plaklar görselleştirmek. Bunun için, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 0,5 mL/kuyu permeabilizasyon çözeltisi kullanarak 1x PBS’yi çıkarın, hücreleri geçirin. Permeabilizasyon çözeltisini çıkarın, hücreleri 1x PBS ile üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca 0,5 mL/kuyuile bloklayın. Blokaj çözeltisini adım 4.4.9’dan çıkarın ve pAb anti-Nluc’un 0,5 mL/kuyusu ile hücreleri 37 °C’de 1 saat seyreltme çözeltisinde 1:1.000 seyreltme çözeltisi ile inkübe edin. Nluc ifade plaklar görselleştirme için üreticinin tavsiyesi aşağıdaki ABC Alkalifosfataz kiti ve DAB Peroksidaz Substrat Kiti kullanın. Kısaca, 4.4.10’dan üç kez 1x PBS ile hücreleri yıkayın ve 0.5 mL/kuyu ile 37 °C’de 1 saat boyunca biyotinylated anti-tavşan ikincil antikor ile kuluçkaya yatırın. Sekonder antikorları çıkarın, hücreleri 1x PBS ile üç kez yıkayın ve 37 °C’de 1 saat boyunca ABC çözeltisi ile kuluçkaya yatırın. Hücreleri 1x PBS ile üç kez yıkayın ve DAB HRP substrat Kiti ile viral plakları görselleştirin. Konvansiyonel bir tarayıcı kullanarak immünolekeli plakları tarayın.NOT: İmmünoboyama için diğer benzer kitleri kullanılabilir. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca kristal mor çözeltiile viral plaklar leke. Kristal menekşe atın, su ile üç kez plakaları yıkayın, plakalar kurumasını bekleyin ve tekrar plakaları taranır. Viral titreleri belirlemek için, kristal mor boyama sonra ortaya plaklar saymak. Geleneksel bir tarayıcı kullanarak plakları tarayın. ML başına plak şekillendirme üniteleri (PFU) (PFU/mL) olarak virüs titretini hesaplayın. Vivo’da BIRFLU kararlılığını değerlendirmek için, kristal mor-lekeli plakların (bulaşıcı virüs sayısı, adım 4.4.12) sayısını sayarak muhabiri ifade eden virüslerin yüzdesini hesaplayın ve Venüs ve Nluc ifade eden plakların sayısıyla karşılaştırın ( adım 4.4.7 ve adım 4.4.11, sırasıyla).