فيروس أنفلونزا مراسل لوسيفيراز الفلورسنت للتصوير الحي والقياس الكمي للعدوى الفيروسية
Summary
فيروسات الأنفلونزا A (IAVs) هي مسببات أمراض الجهاز التنفسي المعدية التي تسبب الأوبئة السنوية والأوبئة العرضية. هنا، نقوم بوصف بروتوكول لتتبع العدوى الفيروسية في الجسم الحي باستخدام لوسيفيراز المؤتلف الجديد والفلورة التعبير عن ثنائي مراسل IAV (BIRFLU). يوفر هذا النهج للباحثين أداة ممتازة لدراسة IAV في الجسم الحي.
Abstract
تسبب فيروسات الأنفلونزا A (IAVs) أمراضًا تنفسية بشرية ترتبط بعواقب صحية واقتصادية كبيرة. وكما هو الحال مع الفيروسات الأخرى، تتطلب دراسة المركبات المضادة للمركبات استخدام نُهُج ثانوية شاقة للكشف عن وجود الفيروس في الخلايا المصابة و/أو في النماذج الحيوانية للعدوى. وقد تم التحايل على هذا القيد مؤخرا مع توليد IAVs المؤتلف التعبير عن البروتينات الفلورسنت أو الإنارة الحيوية (luciferase) يمكن تتبعها بسهولة. ومع ذلك، اضطر الباحثون إلى اختيار الجينات مراسل الفلورسنت أو لوسيفيراز بسبب القدرة المقيدة للجينوم IAV لإدراج تسلسل الأجنبية. وللتغلب على هذا القيد، قمنا بإنشاء مراسل ثنائي للإرسال (BIRFLU) مؤتلف في النسخ المتماثل، يعبر بحالة عالية عن كل من الفلورسنت وجين مراسل لوسيفيراز لتتبع عدوى IAV بسهولة في المختبر وفي الجسم الحي. ولهذا الغرض، تم تعديل الأجزاء الفيروسية غير الهيكلية (NS) والهيماغلوتينين (HA) من الأنفلونزا A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) لترميز الزهرة الفلورية وبروتينات النانولوك لوسيفيراز المضيئة بيولوجياً، على التوالي. هنا، ونحن نصف استخدام BIRFLU في نموذج الماوس من العدوى IAV والكشف عن كل من الجينات مراسل باستخدام نظام التصوير في الجسم الحي. وتجدر الإشارة إلى أننا لاحظنا وجود ارتباط جيد بين تعبيرات كل من الصحفيين والنسخ المتماثل الفيروسي. مزيج من التقنيات المتطورة في البيولوجيا الجزيئية، والبحوث الحيوانية وتقنيات التصوير، ويوفر للباحثين فرصة فريدة لاستخدام هذه الأداة لبحوث الأنفلونزا، بما في ذلك دراسة التفاعلات بين الفيروس والمضيف وديناميات العدوى الفيروسية. والأهم من ذلك أن جدوى تغيير الجينوم الفيروسي وراثياً للتعبير عن جينتين أجنبيتين من مختلف القطاعات الفيروسية تتيح فرصاً لاستخدام هذا النهج من أجل: ‘1’ تطوير لقاحات جديدة للمركبات المضادة للمركبات، ‘2’ توليد مركبات عالية الأجانب المؤتلفة التي يمكن استخدامها كناقلات لقاح لعلاج العدوى المسببة للأمراض البشرية الأخرى.
Introduction
فيروس الأنفلونزا A (IAV) هو فيروس RNA مُلفّق ذو إحساس سلبي من عائلة Orthomyxoviridae 1و2و3. وتقدر منظمة الصحة العالمية 3-5 ملايين حالة انفلونزا سنوية وأكثر من 250,000 حالة وفاة من الأنفلونزا في جميع أنحاء العالم4,5,6. وتشمل المجموعات المعرضة بشكل خاص للإنفلونزا كبار السن،والأفراد الذين يعانون من نقص المناعة، والأطفال 7،8،9،10،11. على الرغم من أن اللقاحات متوفرة وتمثل التدخل الأكثر شيوعا وفعالية ضد العدوى الفيروسية، فإن الأياف قادر على التطور بسرعة والهروب من الحصانة الموجودة مسبقا3،12،13، 14 سنة , 15– إن عودة ظهور سلالة من الأوبئة H1N1 في عام 2009 وظهور مركبات IAV المسببة للأمراض تؤكد من جديد التهديد المستمر للصحة العامة البشرية في جميع أنحاء العالم4و16.
وخلال الوباء أو الوباء، من الأهمية بمكان أن نحدد بسرعة مسببات الأمراض وإمكانية نقل الفيروسات المعزولة حديثا. التقنيات المتاحة حاليا للكشف عن الفيروس تستغرق وقتا طويلا وتتطلب في بعض الأحيان استخدام النهج الشاقة، والتي يمكن أن تؤخر الانتهاء من هذه التحليلات17،18،19،20. وعلاوة على ذلك، من الصعب توسيع نطاق الاختبارات الفيروسية الحالية، وهو ما قد يكون ضرورياً أثناء حالة تفشي المرض. وأخيراً، فإن استخدام النماذج الحيوانية التي تم التحقق من صحتها للعدوى، مثل الفئران والخنازير الغينية والعفاريت، يُستخدم بصورة روتينية، وهو أمر حيوي في دراسة عدوى الأنفلونزا، والاستجابات المناعية، وفعالية اللقاحات الجديدة و/أو مضادات الفيروسات. ومع ذلك, هذه النماذج مقيدة بسبب عدم القدرة على مراقبة الديناميات الفيروسية في الوقت الحقيقي; وهذا يحد من الدراسات إلى التصوير الثابت للعدوى الفيروسية21،22،23،24،25. كما يتم قتل الحيوانات المستخدمة في هذه الاختبارات من أجل تحديد الحمل الفيروسي، وبالتالي زيادة عدد الحيوانات المطلوبة لإكمال هذه الدراسات26. وللتحايل على جميع هذه القيود، يعتمد العديد من الباحثين على استخدام المركبات المضادة للتكرار المؤتلفة والقابلة للتكرار وتعبر عن المراسل، والتي هي قادرة على تسريع الاختبارات الفيروسية والكشف عن الحمل الفيروسي والنشر في الجسم الحي في الوقت الحقيقي26 ،27،28،29،30،31،32،33،34،35 ،36،37،38،39،40،41. الأهم من ذلك، هذه IAVs التعبير عن مراسل قادرة على تكرار بالمثل إلى البرية من نوع (WT) IAVs في ثقافة الخلايا وفي النماذج الحيوانية للعدوى33،42.
البروتينات الفلورية والمضيئة بيولوجيا هي اثنين من أنظمة المراسلين التي يستخدمها الباحثون عادة بسبب حساسيتها واستقرارها وسهولة استخدامها. وبالإضافة إلى ذلك، هناك دعم هائل والتقدم في تقنيات الكشف عن البروتين الفلورسنت وbioluminescent43،44،45،46،47،48 . البروتينات الفلورية وluciferase لها خصائص مختلفة تسمح لهم بتوهج، تختلف على وجه التحديد في كيفية توليد الدول متحمس وكيف يتم الكشف عن emittance43،44،45، 46و47و48. البروتينات الفلورية هي متحمس ة أولا عن طريق امتصاص الطاقة، والتي يتم إصدارها في وقت لاحق كضوء في الطول الموجي مختلفة كما تنخفض الجزيئات إلى حالة طاقة أقل43. من ناحية أخرى ، يتم اشتقاق الإنارة الحيوية من تفاعل طارد الطارد للضوء الكيميائي الذي ينطوي على الركيزة ، والأكسجين ، وأحيانا ATP من أجل إنتاج الضوء45. بسبب خصائص متفاوتة من هذين النوعين من البروتينات مراسل، واحد ربما أكثر فائدة من الآخر اعتمادا على دراسة الفائدة. في حين تستخدم البروتينات الفلورية على نطاق واسع لمراقبة توطين الخلوية28،41، إشاراتها في الجسم الحي لها كثافة غير كافية وغالبا ما تحجبها autofluorescence في الأنسجة الحية49. ولذلك، يعتمد الباحثون على لوسيفيراز لتقييم الديناميات الفيروسية في الكائنات الحية، على الرغم من أن البروتينات الفلورية يمكن أن يفضل لدراسات الجسم الحي السابق50،51،52،53. على عكس البروتينات الفلورية، luciferases هي أكثر ملاءمة لدراسات الجسم الحي وأكثر قابلية للتطبيق في النهج غير الغازية26،27،28،29،30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. فينهاية المطاف، استنادا إلى نوع من الدراسة، يجب على الباحثين الاختيار بين استخدام إما الفلورسنت أو بروتين مراسل لوسيفيراز كقراءة، والتي تخضع دراستهم لمقايضة الوظائف والحساسيات، وبشدة يحد من فائدة فيروسات المراسل المؤتلف. وعلاوة على ذلك، هناك مخاوف بشأن الترابط بين التعبير عن جينات المراسلين المختلفة باستخدام نظم الفلورة أو اللوسيفيرس والنسخ أو النشر الفيروسي، مما قد يعرض للخطر تفسير البيانات التي يتم الحصول عليها باستخدام مراسل التعبير عن IAVs.
لقد تغلبنا على هذا القيد من خلال توليد النسخ المتماثل المؤتلف المختصة ثنائي مراسل IAV (BIRFLU) التي ترميز لكل من الفلورسنت وبروتين لوسيفيراز في نفس الجينوم الفيروسي55 (الشكل1). هنا، تم إدراج NanoLuc luciferase (نلوك)، وهو بروتين حيوي صغير ومشرق48، في أعلى مجرى تسلسل الهيماغلوتينين (HA) في الجزء الفيروسي HA من الأنفلونزا A/Puerto Rico/08/1934 H1N1 (PR8)24،33، 40،55،56،57. وبالإضافة إلى ذلك، تم إدراج الزهرة، وهو بروتين الفلورسنت الأحادي المستخدمة في كثير من الأحيان، في الجزء الفيروسي غير الهيكلي (NS)32،33،36،41،55. منذ BIRFLU ترميز لكل من الجينات الفلورسنت وluciferase مراسل، إما إشارة البروتين مراسل يمكن استخدامها كقراءة لتحديد النسخ المتماثل الفيروسية ونشرها في المختبر أو في الجسم الحي55. ويمكن الاطلاع على معلومات إضافية بشأن توليد وتوصيف في المختبر أو في الجسم الحي من BIRFLU في المنشور الأخير55. يمكن استخدام BIRFLU لاختبار فعالية الأدوية المضادة للفيروسات أو تحييد الأجسام المضادة عن طريق اختبار التحييد الدقيق الجديد القائم على الفلورسنت والإضاءة الحيوية55. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا استخدام BIRFLU لتقييم الديناميات الفيروسية في نموذج الماوس للعدوى55. في هذه المخطوطة، نقوم بوصف الإجراءات التي تميز BIRFLU55 في المختبر وكيفية دراسة عدوى BIRFLU في الفئران باستخدام أنظمة التصوير الإنارة في الجسم الحي للكشف عن النلوك في الجسم الحي أو فينوس في الجسم الحي.
مزيج من التقنيات المتطورة في البيولوجيا الجزيئية, بحوث الحيوانات وتقنيات التصوير, يجلب للباحثين فرصة فريدة لاستخدام BIRFLU لبحوث IAV, بما في ذلك دراسة التفاعلات الفيروسية المضيفة, ديناميات العدوى الفيروسية; تطوير نُهُج لقاح جديدة للعلاج العلاجي لعدوى المركبات المضادة للمركبات أو الاستخدام المحتمل للمركبات المضادة للمركبات كناقل للقاحات لعلاج العدوى المسببة للأمراض الأخرى.
Protocol
وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها واللجنة المؤسسية للسلامة البيولوجية في جامعة روتشستر، كلية الطب وطب الأسنان، على جميع البروتوكولات المتعلقة بالفئران. جميع التجارب التي أجريت في الحيوانات تتبع التوصيات الواردة في دليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية للمجلس الوطني للبحوث58. تم اعتماد Vivarium وشعبة مرافق الطب الحيواني المختبري في كلية الطب وطب الأسنان في جامعة روتشستر من قبل جمعية تقييم واعتماد العناية بالحيوانات المختبرية (AALAC) الدولية و تتوافق مع القوانين الاتحادية وقوانين الولايات وسياسة المعاهد الوطنية للصحة(NIH). مطلوب معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) عند العمل مع الفئران. وينبغي تنفيذ سياسات ومتطلبات مماثلة عند إجراء التجارب المبينة في هذه المخطوطة في كل مؤسسة. 1. استخدام الحيوانات الفقارية الصغيرة شراء الفئران من خمسة إلى سبعة أسابيع من العمر من الإناث BALB / C والحفاظ عليها في مرفق رعاية الحيوانات في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض. عند وصول الفئران إلى المرافق المحددة، اسمح بفترة راحة لمدة 4-5 أيام للسماح للالحيوانات بالتكيف مع بيئتها الجديدة. بعد بروتوكولات IACUC، ضع 5 فئران كحد أقصى لكل قفص.ملاحظة: في نهاية التجربة، من أجل ضمان أن يكون الحيوان ميتا، تم قتل الفئران باستخدام اثنين من الإجراءات المعتمدة، مع الأخذ في الاعتبار أن الثاني يجب أن يكون وسيلة مادية. في هذه الدراسة، بعد عدوى الفئران مع بيرفلو وفي التصوير الحي، يتم قتل الحيوانات بجرعة قاتلة من 2،2،2-ثلاثي البروم الإيثانول (TBE)، وعن طريق قطع الوريد الكبدي كطريقة ثانوية فيزيائية كما أظهرنا سابقا23. 2 – السلامة الأحيائية ملاحظة: في هذه المخطوطة، تم إنشاء BIRFLU في العمود الفقري للإنفلونزا A/Puerto Rico/08/34 H1N1 (PR8)، وهو مختبر مشترك مكيف مع الماوس سلالة IAV23،32،33،56. تم توليد الفيروس باستخدام النهج التي سبق وصفها على أساس بلازميد عكس علم الوراثة ووصف كامل للجيل، وفي المختبر وفي وصف الجسم الحي من BIRFLU يمكن العثور عليها في المنشور الأخير55. وقد أجريت جميع الإجراءات التي تنطوي على التهابات المركبات المضادة للمركبات (في المختبر أو في الجسم الحي) في خزانة السلامة البيولوجية تحت مستوى السلامة البيولوجية (BSL)-2 الشروط. تحذير: </ وينبغي تحديد مستوى مناسب للسلامة الأحيائية وفقا لتقييم مخاطر السلامة الأحيائية. وينبغي الرجوع إلى معلومات إضافية عن إجراء تقييمات لمخاطر السلامة الأحيائية وإنشاء احتواء فعال للسلامة الأحيائية مع المؤسسة التي ستجري فيها التجارب. تنظيف خزانات السلامة البيولوجية مع 70٪ الإيثانول أو مطهر ثاني أكسيد الكلور قبل وبعد إجراء جميع الإجراءات التجريبية. لعمل الفئران، تعقيم جميع المواد تشريح (مقص، تشريح ملقط، وما إلى ذلك) والمجانسة Dounce قبل وبعد استخدامها. تجاهل جميع المواد البيولوجية المنتجة أثناء الإجراءات بموجب المبادئ التوجيهية السليمة لاتفاقية بازل وIACUC. 3. توصيف في المختبر من بيرفلو (الشكل 2) ملاحظة: راجع الجدول 1 لكافة تركيبات الوسائط العازلة والوسائط. تحليل التعبير عن البروتين عن طريق الفلورة (الشكل 2A) والفلورة المناعية غير المباشرة (الشكل 2B) قبل يوم واحد من العدوى، والبذور 24 جيدا لوحات مع مادين داربي الكلاب الكلى (MDCK) الخلايا الظهارية (1 × 105 خلايا / جيدا، triplicates) في وسائل الإعلام ثقافة الأنسجة والحفاظ على لوحات في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. إعداد ما يكفي من الآبار لتقييم جميع الأجسام المضادة المختارة في كل من الخلايا المصابة وهمية وBIRFLU.ملاحظة: نوصي بتصور الخلايا تحت المجهر الخفيف لتأكيد طبقة أحادية قبل بدء العدوى الفيروسية. يوصى بطبقة أحادية من خلايا MDCK بنسبة 90% بحلول وقت العدوى. إعداد تمييع WT أو BIRFLU IAVs في وسائل الإعلام العدوى وتصيب خلايا MDCK المصنفة مع تعدد العدوى (MOI) من 0.1 وحدات تشكيل البلاك (PFU) لكل خلية في حجم نهائي من 0.25 مل / جيدا من وسائل الإعلام العدوى. إزالة وسط زراعة الأنسجة من الخطوة 3.1.1 وغسل خلايا MDCK مرتين مع 1X الفوسفات المخزنة مؤقتا المالحة (PBS). إضافة تخفيف الفيروس من 3.1.2 إلى خلايا MDCK ووضع لوحات على منصة هزاز لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة للسماح الامتزاز الفيروسي.ملاحظة: يتم احتضان الخلايا المصابة وهمية فقط مع وسائل الإعلام العدوى في غياب الفيروس. بعد الامتزاز الفيروسي (الخطوة 3.1.3)، وإزالة التلقيح الفيروسي عن طريق الطموح وإضافة 1 مل من وسائل الإعلام ما بعد العدوى التي تحتوي على 1 ميكروغرام / مل من التربسين TPCK المعالجة إلى كل بئر. حضانة الخلايا لمدة 18 ساعة في حاضنة مرطبة CO2 5٪ عند 33 درجة مئوية. بعد 18 ساعة من العدوى، قم بإزالة ثقافة الأنسجة الفائقة من لوحات 24-well (3.1.4). إصلاح وpermeabilize الخلايا مع 0.25 مل / بئر التثبيت / نفاذيبيليت الحل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.ملاحظة: إعداد حل التثبيت / نفاذيبيليت في غطاء الدخان لمنع التعرض الفورمالديهايد. إزالة حل التثبيت / نفاذية من الخطوة 3.1.5، وغسل الخلايا مرتين مع 1X PBS، وحضانة الخلايا مع 0.25 مل / جيدا من حل حظر لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.ملاحظة: انتقل إلى الخطوة التالية أو قم بتخزين الخلايا في حظر الحل عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. إزالة الحل حظر (الخطوة 3.1.6) وإضافة 0.25 مل / جيدا (1 ميكروغرام / مل) من الأجسام المضادة أحادية النسيلة الماوس (MAb) ضد البروتين النووي IAV، NP (HB-65) أو تخفيف 1:1000 من جسم مضاد متعدد الكلون أرنب (pAb) ضد NLuc (انظر جدولالمواد)، كلاهما مخفف في محلول تخفيف الأجسام المضادة (1X PBS، 2.5٪ BSA)، وحضانة الخلايا لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية. إزالة الأجسام المضادة الأولية من الخطوة 3.1.7، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 1X PBS واحتضانلهم مع 0.25 مل / بئر من الأجسام المضادة للماوس الأحمر أو المضادة للأرنب المضادة للأرنب (انظر جدولالمواد) المخففة 1:200 في الأجسام المضادة تخفيف الحل.ملاحظة: يمكن تلوين نوى الخلية في نفس الوقت عن طريق إضافة 0.5 ميكروغرام / مل من 4 ‘، 6 ‘-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) إلى نفس محلول الأجسام المضادة الثانوية. احتضان الخلايا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في الظلام. ويمكن استخدام الأجسام المضادة الثانوية الأخرى المترافقة مع الفلوروفوريات الأخرى. إزالة الأجسام المضادة الثانوية وDAPI من الخطوة 3.1.8، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع PBS 1x. بعد الغسيل، اترك الخلايا في 0.25 مل / بئر من 1X PBS. وضع لوحة على خشبة المسرح من المجهر الفلوري للكشف عن الزهرة ونلوك التعبير مراسل، وNP من الخلايا المصابة باستخدام مرشحات الفلورسنت المناسبة. التقاط الصور باستخدام المجهر الفلوري (التكبير 20X) ودمجها باستخدام برنامج تحرير الصور (الشكل2A،B). تحليل نشاط نلوك (الشكل2C)والنسخ المتماثل الفيروسي (الشكل2D). قبل يوم واحد من العدوى، والبذور 12 جيدا لوحات مع خلايا MDCK (2 × 105خلايا / جيدا، triplicates) باستخدام وسائل الإعلام ثقافة الأنسجة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 للوصول إلى ما يقرب من 90٪ الملاءمة بحلول وقت العدوى.ملاحظة: قبل العدوى، تحقق من الخلايا تحت المجهر للتحقق من طبقة أحادية من خلايا MDCK. يوم العدوى إعداد التخفيفات من فيروسات WT وBIRFLU في وسائل الإعلام العدوى لإصابة خلايا MDCK (الخطوة 3.2.1.) في ثلاثة أضعاف مع وزارة الداخلية من 0.001 PFU في 0.5 مل / جيدا. إزالة وسط زراعة الأنسجة وغسل خلايا MDCK مرتين مع 1X PBS. إضافة تخفيف الفيروس إلى الطبقات الأحادية MDCK والسماح الامتزاز الفيروسي في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على منصة هزاز. بعد الامتزاز الفيروسي، قم بإزالة تلقيح الفيروس وإضافة 1.5 مل من وسائل الإعلام بعد العدوى التي تحتوي على 1 ميكروغرام /مل من التربسين المعالجة TPCK، إلى كل بئر. حضانة الخلايا المصابة في حاضنةمرطبة بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون عند 33 درجة مئوية وجمع المواد فوق ية في النقاط الزمنية المشار إليها في الخطوة 3.2.4. في 24، 48، 72، و 96 ح بعد العدوى (p.i.) جمع 150 ميكرولتر من supernatant ثقافة الأنسجة من كل بئر وتخزين العينات في أنبوب الطرد المركزي الجزئي في -80 درجة مئوية لإجراء الاختبارات نلوك واللطانات الفيروسية. لإجراء عملية تحديد نشاط Nluc، اتبع مؤشرات الشركة المصنعة. أولا، ذوبان supernatant زراعة الأنسجة المخزنة في -80 درجة مئوية (الخطوة 3.2.4) على الجليد.ملاحظة: الرجوع إلى التوصيات من الشركة المصنعة وتحسين التبيّن إذا لزم الأمر. إعداد حل فحص لوسيفيراز (انظر جدولالمواد) عن طريق تخفيف الركيزة Nluc 1:50 مع المخزن المؤقت التخفيف. في لوحة بيضاء مسطحة القاع 96 جيدا لتجارب لوسيفيراز، مزيج 25 ميكرولتر من حل فحص لوسيفيراز مع 10 إلى 25 درجة مئوية من عينات supernatant ثقافة الأنسجة التي تم جمعها. قم باحتضان المزيج لمدة 2-3 دقائق قبل قياس الإنارة باستخدام مقياس الإنارة (الشكل2C).ملاحظة: يتم تحديد وجود الجسيمات الفيروسية المعدية في الأنسجة supernatants عن طريق الفلورة اختبار التركيز المناعي (الزهرة) أو الفلورة المناعية غير المباشرة (تلطيخ المستضد الفيروسي) كما سبق وصفه23،32، 33و56. قبل يوم واحد من اللوهيبات الفيروسية، وخلايا MDCK البذور في لوحة 96 جيدا (2 × 104 خلايا / جيدا، triplicates) مع وسائل الإعلام ثقافة الأنسجة والسماح للخلايا للوصول إلى 90٪ التقاء بحلول وقت العدوى في حاضنة تعيين في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. استخدام عينات زراعة الأنسجة الفائقة التي تم إذابة على الجليد (الخطوة 3.2.4.). إضافة 90 درجة مئوية من وسائل الإعلام العدوى إلى كل من الآبار في لوحة جديدة 96 جيدا، ثم إضافة 10 ميكرولتر من ثقافة الأنسجة المذابة supernatant (الخطوة 3.2.4) إلى البئر الأول (الصف A). استخدام pipet متعددة القنوات لخلط ونقل 10 ميكرولتر من الصف A إلى الصف B. تغيير النصائح بين تخفيف وخلط جيدا.ملاحظة: يجب تكرار هذا الإجراء حتى الصف الأخير (H). نوصي بإجراء التبلّت الفيروسي في الثلاثية لقياس دقيق للtiters الفيروسية. إزالة وسط زراعة الأنسجة من خلايا MDCK في لوحات 96 جيدا (الخطوة 3.2.7) وغسل مرتين مع 1X PBS. إضافة 50 درجة مئوية من التخفيفات الفائقة من طبق النسخة المتماثلة 96-جيدا تحتوي على تخفيف الفيروس (الخطوة 3.2.8) إلى كل بئر في لوحة 96 جيدا تحتوي على خلايا MDCK. احتضان لوحة 96 جيدا على منصة هزاز لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة للسماح الامتزاز الفيروسي. بعد الامتزاز الفيروسي، قم بإزالة التلقيح وإضافة 100 ميكرولتر/بئر من وسائل الإعلام بعد العدوى التي تحتوي على 1 ميكروغرام/مل من التربسين المعالج بـ TPCK. حضانة الخلايا المصابة لمدة 12 ساعة في حاضنة33 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. وبما أن BIRFLU تعبر عن الزهرة، يمكن حساب عدد الخلايا المصابة مباشرة باستخدام مجهر الفلورة. بدلا من ذلك، يمكن تحديد titers الفيروسية عن طريق الفلورة المناعية غير المباشرة كما هو موضح سابقا باستخدام جسم مضاد ضد البروتين الفيروسي23،56،57،59. وفيما يتعلق بهذه الأخيرة، انتقل إلى إصلاح/نفاذية الخلايا ووصمة عار باستخدام الـ 100 000 المضادة للشرطة الوطنية HB-65 على النحو المبين في الفرع 4-4. تحديد titers الفيروسية عن طريق حساب عدد وحدات تشكيل الفلورسنت (FFU) / مل باستخدام الصيغة: ((عدد FFU) × 20 × 1 / تخفيف (الشكل2D). 4. في توصيف الجسم الحي من BIRFLU (الشكل3 والشكل 4) عدوى الماوسملاحظة: تم إجراء عدوى داخل الأنف من الفئران كما هو موضح سابقا23. للحصول على بروتوكول أكثر تفصيلا من العدوى IAV في الجسم الحي باستخدام نموذج الماوس للعدوى، ونحن نوصي بعرض الفيديو المرتبطة المنشور السابق23. يلخص هذا القسم فقط الخطوات المطلوبة لعدوى الماوس مع BIRFLU. فحص الفئران لتقييم صحتهم والمظهر البدني العام. إعداد تخفيف BIRFLU في 1X PBS لتلقيح الفئران مع 1 × 106 PFU من BIRFLU في حجم إجمالي قدره 30 ميكرولتر / الماوس. الحفاظ على الفيروس على الجليد حتى تلقيح الماوس.ملاحظة: سوف تكون هناك حاجة إلى الفئران المصابة وهمية (1X PBS) كرقابة داخلية للتصوير. وضع الفئران المصابة وهمية في قفص مختلف عن الحيوانات المصابة BIRFLU. التخدير الإناث BALB /c الفئران البالغة من العمر خمسة إلى سبعة أسابيع داخل اقصاب مع 240-250 ملغ /كغ من ثلاثي البروم الإيثانول (TBE) عن طريق إدخال الإبرة في الكُد 2/3 من الجانب الأيمن من البطن. ثم، والعودة الماوس إلى القفص والانتظار لمدة 5 دقائق.ملاحظة: يوصى بالمهدئات عن طريق الحقن على المهدئات المستنشقة لعدوى الأنفلونزا في الجسم الحي، حيث يمكن لهذه الأخيرة تعديل سلوك والالكترونيات والعدوى عن طريق ظهارة مجرى الهواء. وعلاوة على ذلك، فإنها يمكن أن تؤثر أيضا على الاستجابات المناعية المحلية للرئة وتتداخل مع التصوير في الجسم الحي للفئران المصابة. وأخيرا، خفضت المهدئات المستنشقة مدة التأثير، والتي من شأنها أن تكون مشكلة في التصوير الحي للالحيوانات المصابة. تلقيح الفئران intranasally مع 30 درجة مئوية من التخفيف BIRFLU أعدت. تحقق من أن الفئران تتنفس بشكل صحيح قبل إعادتها إلى القفص. رصد الإنارة الحيوية للفئران المصابة ببيرفلو (الشكل 4A)ملاحظة: في هذا التعبير مراسل مخطوطة من Nluc أو الزهرة والنسخ المتماثل الفيروسي في الرئتين من الفئران المصابة BIRFLU يتم تحديدها في 3 أيام بعد العدوى. ومع ذلك، فإن طبيعة التصوير بالإنارة الحيوية تسمح بالرصد المتكرر للتعبير النلوك في الحيوانات المصابة بBIRFLU الفردية دون الحاجة إلى قتلها في كل نقطة زمنية تجريبية. مطلوب نظام تصوير في الجسم الحي مع مشعب التخدير isoflurane لتنفيذ الإجراءات التجريبية الموصوفة. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول أداة التصوير وبرامج الصور المستخدمة في الحصول على الصور وتحليل البيانات. ابلل صدر الفئران لتحسين إشارة الإضاءة الحيوية. افتح برنامج التصوير واضغط على تهيئة. بعد ذلك، قم بتعيين المعلمات التي سيتم استخدامها، بما في ذلك تعيين وضع التصوير للإنارة الحيوية، وتوفير السيارات، ووقت التعرض للتلقائي، وفتح فلتر، الخ. بمجرد تهيئة الجهاز بالكامل، قم بتشغيل نظام التخدير isoflurane. ضع الحيوانات في غرفة التخدير. يتم التخدير الفئران في وقت واحد وطفيفة مع خليط من غاز الأكسجين وتبخر تتبخر 1-2٪ isoflurane. مرة واحدة يتم تخدير الفئران، وإدارة الركيزة نولوك (انظر جدولالمواد) المخفف 1:10 في 1X PBS (المجلد النهائي 100 € L / الماوس) عبر الطريق الرجعية المدارية باستخدام حقنة مع إبرة 22 G. مباشرة بعد إدارة الكاشف Nluc، وضع الحيوانات في جهاز التصوير مع صدورهم التي تواجه صعودا والوضعم داخل مخروط متعددة للحفاظ على التخدير الحيوان أثناء التصوير. مباشرة بعد إغلاق باب الصور، انقر فوق اكتساب في البرنامج (الشكل4A،أعلى). بعد التصوير، والعودة الفئران إلى أقفاصها رصدلهم حتى أنها قد تعافى تماما وإيقاف المرذاذ isoflurane. ثم، المضي قدما في التصوير الجسم الحي السابق من الفئران الرئتين لتقييم التعبير الجيني مراسل الزهرة (القسم 4.3). استخدم أدوات برامج التصوير لتحليل بيانات الإضاءة الحيوية المكتسبة. استخدم عائد الاستثمار للأداة (منطقة الاهتمام) لتعيين إشارة محددة وإجراء قياسات التدفق في المنطقة ذات الأهمية (عادة حول الصدر) (الشكل4A،أسفل). على الرغم من أن شكل عائد الاستثمار غير ذي صلة، يفضل عادة ً أن تلتقط ROIs الأكبر منطقة نشر الإشارة بأكملها. انقر فوق قياس. تقييم الإنارة الأحيائية في الفوتونات لأنها توفر قياس انبعاثات فوتون مطلق مماثل لقياسات النواتج التي توفرها بارامترات أو أدوات تصوير مختلفة. تحليل الفلورة في الفئران المصابة BIRFLU (الشكل3 والشكل 4B) جمع الرئتين الماوس بعد في التصوير الجسم الحي، كما سبق وصفه23. باختصار، قتل الفئران بجرعة مميتة من TBE (500 ملغ /كغ). تطهير موقع الشق مع الإيثانول 70٪. مع مشرط، وجعل شق من القص إلى قاعدة البطن ومن ثم قطع من الجزء السفلي من الشق إلى الجانبين مع مقص. بعد ذلك، قطع الوريد الكبدي (طريقة القتل الرحيم الجسدي ة الثانية) لنزيف الحيوان.ملاحظة: لتجنب إشارة خلفية عالية أثناء التصوير، من المهم تقليل كمية الدم في الرئتين (انظر أدناه). وضع الماوس في recumbency الظهرية، واستخدام مقص لقطع الجنبة وفتح القفص الصدري. في وقت لاحق، إزالة الرئتين عن طريق قص نهاية القصبة الهوائية مع مقص في حين عقد بلطف الرئتين مع ملقط. وضع الرئتين في لوحة ستة جيدا مع 2 مل من 1X PBS وغسل الرئتين ثلاث مرات مع 1X PBS.ملاحظة: لتجنب التلوث بين العينات، تنظيف وتطهير أدوات التشريح بين كل الحيوان. بدء تشغيل برنامج الحصول على الصور عن طريق تهيئة انقر فوق تعيين المعلمات للتصوير، بما في ذلك وضع التصوير إلى الفلورة، والحفظ التلقائي، ووقت التعرض للسيارات، والإثارة (500 نانومتر) والانبعاثات (540 نانومتر) مرشحات. عند تهيئة الجهاز، ضع الرئتين في علبة خلفية سوداء، مع التأكد من فصل الأنسجة عن بعضها البعض، وإدخال الدرج في الصور، وانقر على الحصول على برنامج نظام التصوير بعد إغلاق باب الصور ( الشكل 4B،أعلى). بعد التصوير، قم بإزالة الأنسجة على الفور وتخزينها على الجليد (4 درجة مئوية) إذا تمت معالجة العينات في نفس اليوم. أو على أنبوب والجليد الجاف لتجميدها بسرعة، قبل تخزينها في -80 درجة مئوية، إذا سيتم معالجة العينات في وقت لاحق في يوم مختلف. لمعالجة الصور، حدد أداة عائد الاستثمار وارسم عائد الـ ROIs حول كل من الرئتين الفردية. انقر فوق قياس. ثم، باستخدام متوسط قياسات الكفاءة مشع الناتجة، طرح القيم من الفئران وهمية المصابة (الشكل4B،أسفل).ملاحظة: مع BIRFLU، هناك ارتباط جيد من مستويات التعبير Nluc والزهرة، وتوزيع إشارة. لذلك، من المهم تحليل Nluc (الماوس كله) والزهرة (الرئتين المقتطعة) التعبير من نفس الحيوان، والحفاظ على نفس الاتجاه. تقييم النسخ المتماثل BIRFLU في الفئران الرئتين (الشكل3 والشكل 4C) تجانس الفئران الرئتين للمعايرة الفيروسية عن طريق فحص البلاك كما سبق وصفه23. ضع الرئتين في الخالطون Dounce مع 1 مل من وسائل الإعلام العدوى المبردة. تجانس الرئتين مع الآفات لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة حتى تفككت تماما وتخزين العينات في أنبوب معقم في 4 درجة مئوية. طرد مركزي العينات في 300 × ز لمدة 10 دقيقة وجمع supernatant في أنبوب معقمة. تخزين العينات على الجليد إذا كانت ستستخدم في نفس اليوم أو تجميدها في -80 درجة مئوية لتقييم titers الفيروسية في وقت لاحق.ملاحظة: وينبغي استخدام الخالطون Dounce جديدة لكل عينة الرئة. لإجراء فحص البلاك، في اليوم السابق لإجراء المعايرة الفيروسية، البذور لوحات ستة جيدا مع خلايا MDCK (5 × 105 خلايا / جيدا) في وسائل الإعلام ثقافة الأنسجة. حضانة الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 للوصول إلى 90٪ التقاء اليوم التالي. قبل العدوى، تأكد من أن الخلايا تشكل طبقة أحادية تحت المجهر الخفيف. إعداد 1:10 التخفيفات التسلسلية من supernatant من العينات المتجانسة (الخطوة 4.4.1) في وسائل الإعلام العدوى. إعداد أنابيب الطرد المركزي الدقيقة مع 540 درجة مئوية من وسائل الإعلام العدوى، إضافة 60 درجة مئوية من عينة الرئتين متجانسة إلى الأنبوب الأول، ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا، ومن ثم استخدام طرف جديد، ونقل 60 ميكرولتر إلى الأنبوب التالي. كرر عملية التخفيف التسلسلي هذه حتى التخفيف الأخير.ملاحظة: في تجربتنا 7 تخفيفات كافية لتحديد titers الفيروسية عن طريق فحص البلاك من الرئتين من الفئران المصابة. اغسل خلايا MDCK (الخطوة 4.4.3) مرتين مع 1x PBS ونقل 500 ميكرولتر من العينات المخففة تسلسليا إلى كل بئر في لوحة ستة آبار. وضع لوحات على منصة هزاز والسماح امتصاص الفيروسية أن يحدث لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد 1 ساعة من الامتصاص الفيروسي، وإزالة التلقيح الفيروسي، إضافة 2 مل / جيدا من تراكب المتوسطة التي تحتوي على 1 ميكروغرام / مل من التربسين TPCK المعالجة، ومن ثم احتضان الخلايا في 33 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 لمدة 3 أيام. إصلاح الخلايا المصابة (الخطوة 4.4.6) مع 1 مل / بئر من 4٪ الفورمالديهايد المخفف في 1X PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة، ثم إزالة بعناية المتوسطة تراكب وإضافة 1 مل من 1X PBS إلى كل بئر. لتصور الزهرة، صورة لوحات ستة آبار مع نظام التصوير للكشف عن الفلورة.ملاحظة: يمكن تلوين لويحات الفيروسية باستخدام برنامج تحرير الصور (انظر جدول المواد). لتقييم التعبير Nluc، تصور لويحات الفيروسية عن طريق تلطيخ المناعة باستخدام pAb المضادة للنلوك. لهذا، إزالة PBS 1X، نفاذية الخلايا باستخدام 0.5 مل / بئر من حل نفاذية لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة حل نفاذية، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 1X PBS وكتلة مع 0.5 مل / جيدا من منع الحل لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. إزالة الحل حظر من الخطوة 4.4.9 واحتضان الخلايا مع 0.5 مل / جيدا من pAb المضادة للنلوك المخففة 1:1000 في حل تخفيف لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية. استخدام ABC القلوية الفوسفاتيز عدة وDAB Peroxidase الركيزة كيت بعد توصية الشركة المصنعة لتصور لويحات Nluc التعبير. باختصار، غسل الخلايا من 4.4.10 ثلاث مرات مع 1X PBS واحتضانلهم مع 0.5 مل / جيدا من الأجسام المضادة للأرنب المضادة للأرنب الحيوي لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية. إزالة الأجسام المضادة الثانوية، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 1X PBS، وحضانة مع حل ABC لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية. غسل الخلايا ثلاث مرات مع 1X PBS وتصور لويحات الفيروسية مع مجموعة الركيزة DAB HRP. مسح لويحات ملطخة بالمناعة باستخدام الماسح الضوئي التقليدية.ملاحظة: ويمكن استخدام مجموعات مماثلة أخرى لتلطيخ المناعة. وصمة عار لويحات الفيروسية مع محلول البنفسج الكريستال لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تجاهل البنفسج الكريستالي، وغسل لوحات ثلاث مرات بالماء، والسماح لوحات لتجف، وتفحص لوحات مرة أخرى. لتحديد البنفسج الفيروسي، عد لويحات كشفت بعد تلطيخ البنفسج الكريستال. مسح اللوحات باستخدام الماسح الضوئي التقليدية. حساب titer الفيروس كوحدات تشكيل البلاك (PFU) لكل مل (PFU / مل). لتقييم استقرار BIRFLU في الجسم الحي، احسب النسبة المئوية للفيروسات التي تعبر عن المراسل عن طريق حساب عدد اللويحات الملطخة بالبنفسج الكريستالي (عدد الفيروسات المعدية، الخطوة 4.4.12) ومقارنتها بعدد اللويحات التي تعبر عن الزهرة ونلوك ( الخطوة 4.4.7 والخطوة 4.4.11 على التوالي).
Representative Results
توليد وتوصيف بيرفلو في المختبر (الشكل 1 والشكل 2) تم بناء IAV المؤتلف المختصة بالنسخ المتماثل للتعبير عن اثنين من الجينات مراسل مختلفة (BIRFLU) باستخدامأحدث البيولوجيا الجزيئية وتقنيات علم الوراثة العكسي القائم على بلازميد (الشكل 1). هنا، اخترنا استخدام Nluc بسبب العديد من المزايا على luciferases الأخرى، بما في ذلك حجمها الصغير، ATP الاستقلال، وكثافة أكبر، والركيزة الأمثل48،60. تم استنساخ Nluc في الجزء HA من IAV PR8 تليها teschovirus porcine (PTV) 2A موقع الانقسام (2A) أمام إطار القراءة المفتوحة (ORF) من HA (الشكل1). وشملت ORF من HA الطفرات الصامتة لإزالة إشارات التعبئة الأصلية وتجنب أي إعادة تركيب ممكنة. تمت إضافة إشارة التعبئة والتغليف HA كاملة أمام Nluc للسماح بالإدماج السليم للجزء HA المعدلة في فيريون ونلوك وها التعبير من نفس الجزء RNA الفيروسية (الشكل1). وبالإضافة إلى ذلك، تم استنساخ البروتين الفلورسنت الزهرة في تعديل IAV PR8 NS الجزء الذي يشفر اثنين من البروتينات الفيروسية NS1 و NEP من نسخة واحدة32،36،41،54، 57. ولهذه الغاية، تم دمج الزهرة إلى محطة C من NS1 وتم استنساخ كامل NEP ORF المصب من موقع الانقسام PTV 2A التي وضعت بين تسلسل NS1-فينوس وNEP (الشكل1). في نهاية المطاف، تم استخدام هذه المنشآت المعدلة HA وNS بلازميد الفيروسية في تركيبة معبقية بلازميدات علم الوراثة العكسي IAV PR8 لتوليد BIRFLU (الشكل 1). وقد تم وصف توصيف في المختبر وفي الجسم الحي من BIRFLU سابقا55. في الشكل 2، تميزنا في المختبر BIRFLU من خلال تحديد مستويات التعبير الزهرة، نلوك، وNP باستخدام الفلورة والنهج المناعية غير المباشرة (الشكل2A،B). كانت الطبقات الأحادية المؤثرة من خلايا MDCK إما مصابة بالعدوى الوهمية أو المصابة (MOI 0.1) مع فيروسات WT أو BIRFLU PR8، وفي 18 ساعة بعد العدوى، تم تقييم تعبير الزهرة مباشرة باستخدام الفحص المجهري الفلوري (الشكل2A،B). تم تصور التعبير Nluc (الشكل2A)وNP (الشكل 2B)من قبل الفلورة المناعية غير المباشرة باستخدام الأجسام المضادة المحددة لكل بروتين. وكما هو متوقع، لم يتم الكشف عن تعبير الزهرة ونلوك إلا في الخلايا المصابة بـ BIRFLU وليس في الخلايا المصابة بفيروس WT PR8. وبالإضافة إلى ذلك، كشف الفحص المجهري غير المباشر عن التعبير عن الفلورة المضادة في كل من الخلايا المصابة بـ WT وBIRFLU PR8. لم يتم الكشف عن أي تعبير عن الزهرة، Nluc أو NP، كما هو متوقع، في الخلايا المصابة وهمية (الشكلA، B). لتقييم مستويات التعبير النلوك في المختبر، تم إصابة خلايا MDCK (MOI 0.001) مع فيروسات WT أو BIRFLU PR8 وتم تقييم نشاط Nluc في المضادات فوق الأنسجة في 24 و 48 و 72 و 96 ساعة بعد العدوى (الشكل2C). تم الكشف عن نشاط النلوك فقط في الأنسجة ثقافة supernatants من خلايا MDCK المصابة BIRFLU (الشكل2C). تم الكشف عن نشاط النلوك في الأنسجة ثقافة supernatants في وقت مبكر من 24 ح بعد العدوى مع مستويات التعبير أعلى في 96 ح بعد العدوى، على الأرجح لأن تأثير السطايرا (CPE) الناجمة عن العدوى الفيروسية الإفراج عن بروتين نلوك الاحتفاظ في الخلية. لتقييم اللياقة البدنية BIRFLU في الخلايا المستزرعة، كما تم تقييم حركية النمو من الفيروسات WT وBIRFLU PR8 (الشكل2D)وتم تحديد وجود الفيروس المعدي في الأنسجة ثقافة supernatants عن طريق فحص التركيز المناعي (الشكل2D ). وتجدر الإشارة إلى أن حركية النسخ المتماثل BIRFLU كانت مماثلة لتلك التي كانت مشابهة لفيروس WT PR8، على الرغم من أن النسخ المتماثل BIRFLU تأخر قليلاً ولم يصل إلى نفس titers الفيروسية مثل WT PR8. ومع ذلك، كان BIRFLU قادراً على الوصول إلى titers من 5 × 107 PFU / مل (الشكل2D)،مما يشير إلى أن التعبير عن اثنين من الجينات مراسل في الجينوم الفيروسي لا تتداخل بشكل كبير مع النسخ المتماثل BIRFLU في خلايا MDCK. تتبع عدوى بيرفلو في الفئران (الشكل 3 والشكل 4) الشكل 3 هو مخطط تدفق تخطيطي لتقييم ديناميات BIRFLU في نموذج الماوس للعدوى IAV. وكانت الفئران من نوع BALB/C من الإناث اللاتي تتراوح أعمارهم بين خمسة وسبعة أسابيع مصابات بإصابة 1x PBS أو المصابات بـ 1 x 106 PFU من BIRFLU intranasally. في 3 أيام بعد العدوى، تم التخدير الفئران مع isoflurane ومن ثم حقن مع الركيزة نلوك الرجعية المدارية. تم وضع جميع الفئران على الفور في جهاز IVIS وتم تقييم إشارة Nluc في الجسم الحي باستخدام IVIS. بعد ذلك، تم قتل الفئران وحصاد الرئتين. ثم تم تحليل الرئتين المقتطعة في الجسم الحي باستخدام الصور في الجسم الحي لتحديد شدة الفلورة عن طريق التعبير الزهرة. وأخيراً، تم تجانس الفئران الرئتين، وتم تحديد titers الفيروسية والاستقرار عن طريق فحص البلاك. تم تقييم لويحات من قبل الفلورة المباشرة من الزهرة، عن طريق تلطيخ المناعة باستخدام الأجسام المضادة المحددة لنلوك والبقع الكريستال البنفسجي. سابقا وصفت النسخ المتماثل المختصة مراسل التعبير عن IAVs التعبير عن جين مراسل واحد, في معظم الأحيان إما الفلورسنت أو بروتين bioluminescent, كبديل للعدوى الفيروسية والنسخ المتماثل. ومع ذلك، BIRFLU، قادرة على التعبير عن كلا النوعين من الجينات مراسل على العدوى الفيروسية. لتقييم العلاقة بين الإنارة الحيوية (في التصوير الحي) والفلورة (التصوير في الجسم الحي السابق) بعد عدوى بيرفلو، كانت فئران BALB/c الإناث البالغات من العمر خمسة إلى سبعة أسابيع مصابات بـ 1x PBS أو تم تلقيحها بـ BIRFLU (106 PFU) بشكل غير قابل للإصابة . تم تقييم نشاط النلوك (الشكل4A)من قبل إدارة الركيزة Nluc حقن الرجعية المدارية في 3 أيام بعد العدوى باستخدام أداة التصوير في الجسم الحي. اخترنا تقييم الإنارة الحيوية في اليوم 3 لأن الدراسات السابقة أشارت إلى أن النسخ المتماثل للمركبات الحية في كوت ديفوار، بما في ذلك PR8، قمم بين الأيام 2 و 4 بعد العدوى24،54. تم رصد الإضاءة الحيوية (الشكل4A،أعلى) وتستخدم لحساب متوسط تدفق إجمالي (تدفق (سجل10 p/s) (الشكل4A،أسفل). وكما هو متوقع، أظهرت الفئران الملقحة بـ BIRFLU نشاط ًا عاليالإضاءة الحيوية ولكن لم يتم اكتشاف أي إشارة في الفئران المصابة بالصورية. بعد ذلك، تم حصاد رئات الفئران المصابة وتم تقييم تعبير الزهرة باستخدام التصوير في الجسم الحي السابق (الشكل4B،أعلى). وعلاوة على ذلك، تم حساب متوسط كفاءة مشع الفلورة (الشكل4B،أسفل). كما تم تجانس الرئتين الفئران المقتطعة لتحديد titers الفيروسية والاستقرار الوراثي لBIRFLU في الجسم الحي (الشكل4C،D). تم تحليل الاستقرار الوراثي لBIRFLU من خلال فحص البلاك باستخدام الفيروسات المعزولة من الرئتين الفئران والمجهرية الفلورسنت (الزهرة، أعلى)، تلطيخ المناعة (نلوك، الأوسط) والكريستال البنفسج تلطيخ (أسفل). بيرفلو تعافى من الفئران الرئتين كانت قادرة على تشكيل لويحات ويعبر عن كل من الجينات مراسل (الشكل 4C). وتجدر الإشارة إلى أننا لاحظنا وجود ارتباط جيد بين الإنارة الأحيائية وإشارات الفلورة مع النسخ المتماثل الفيروسي. الشكل 1: التمثيل التخطيطي لهيكل فيريون IAV PR8 WT وBIRFLU وأجزاء الجينوم. ويحيط بـ IAV طبقة ثنائية الدهون تحتوي على اثنين من البروتينات السكرية الفيروسية الرئيسية هيماغلوتينين (HA؛ أسود) وneuraminidase (NA؛ الأزرق). يحتوي IAV على ثمانية أجزاء أحادية التقطعت بأحرف واحدة، ذات معنى سلبي، RNA (PB2، PB1، PA، HA، NP، NA، M، وNS). يحتوي كل جزء فيروسي على مناطق غير ترميز (NCR) في نهايات 3′ و 5 ‘ (المربعات السوداء). أيضا، في نهاية 3 ‘و 5’ من RNAs الفيروسية (v) هي إشارات التعبئة والتغليف، المسؤولة عن encapsidation كفاءة من vRNAs في virions الوليدة (صناديق بيضاء). يشار إلى IAV PR8 HA وNS القطاعات الفيروسية والمنتجات باللون الأسود. يتم الإشارة إلى تسلسل Nluc، فينوس، وPTV 2A في صناديق الأحمر والأخضر والمخطط، على التوالي. كما يشار إلى التمثيل التخطيطي لجزأي HA وNS المعدلين المعبّرين عن النلوك والزهرة، على التوالي، في بيرفلو. وقد تم تكييف هذا الرقم من Nogales وآخرون55. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: التوصيف في المختبر لبيرفلو. (ألف، باء) تحليل التعبير عن البروتين عن طريق الفلورة المباشرة والفلورة المناعية. كانت خلايا MDCK مصابة أو مصابة (MOI 0.1) بفيروسات PR8 WT أو BIRFLU. تم إصلاح الخلايا المصابة في 18 ح بعد العدوى لتصور مباشرة التعبير الزهرة عن طريق الفحص المجهري الفلورسنت المباشر وتصور Nluc (A) والفيروسية NP (B) التعبير باستخدام الأجسام المضادة محددة والفلورة المناعية غير المباشرة. كانت ملطخة النوى مع DAPI. يتم عرض الصور التمثيلية (التكبير 20x). قضبان مقياس = 100 درجة مئوية. (C, D) حركية النمو من PR8 WT وBIRFLU. تم تقييم نشاط النلوك (C) وtiters الفيروسية (D) في المضادات الناتجة عن زراعة الأنسجة من خلايا MDCK المصابة (MOI 0.001) مع فيروسات WT وBIRFLU PR8 في الأوقات المشار إليها بعد العدوى. البيانات تمثل وسائل ± SD من triplicates. تم تحديد البنفسج الفيروسي عن طريق تحديد التركيز المناعي (FFU / مل). يشير الخط المنقط إلى حد الكشف (200 فرنك فرنسي/مل). وقد تم تكييف هذا الرقم من Nogales وآخرون55. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: التمثيل التخطيطي لدراسة بيرفلو في الفئران. تم تقييم التعبير عن الجينات مراسل Nluc والزهرة في الفئران المصابة 1 × 106 PFU من BIRFLU باستخدام في الجسم الحي أو التصوير في الجسم الحي السابق. وباختصار، في اليوم الأول، كانت فئران من 5 إلى 7 أسابيع من الإناث المصابات بـ BALB/c مصابة بالعدوى الوهمية (1x PBS) أو تم تلقيحها بـ 1 × 106 PFU من BIRFLU intranasally. في اليوم 3 بعد العدوى، تم تخدير الفئران بشكل معتدل باستخدام isoflurane وحقن الركيزة نلوك الرجعية المدارية. تم تقييم إشارة نلوك مباشرة باستخدام التصوير الحي. مباشرة بعد التصوير، تم قتل الفئران وتم تحليل التعبير عن الزهرة في الرئتين المقتطعة كلها باستخدام التصوير خارج الجسم الحي. تم تجانس الرئتين الفئران المستردة لتقييم النسخ المتماثل الفيروسي والاستقرار عن طريق فحص البلاك. تشير الأسهم إلى وجود ارتباط بين الفلورة (الزهرة) وتلطيخ المناعة (نلوك) وتلطيخ البنفسج الكريستالي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: في التعبير عن الإنارة الأحيائية والفلورة. وكانت إناث من خمسة إلى سبعة أسابيع من الفئران BALB/c مصابة بالعدوى وهمية (1X PBS) أو تلقيحها مع 1 × 106 PFU من BIRFLU intranasally. في اليوم 3 بعد العدوى ، تم تحديد نشاط Nluc (أ) في الماوس كله. صور تمثيلية لمسمة واحدة تظهر مقياس التألق(p/sec/cm 2/sr). وقد تم تحديد قيم إشراقة الإنارة الأحيائية كمياً ويظهر متوسط التدفق الكلي (Flux (Log10 p/s). بعد التصوير Nluc، تم حصاد الرئتينلتصوير الجسم الحي السابق (B). يتم عرض الصور التمثيلية من الرئتين بأكملها. ولتحديد التعبير الكمي لكوكب الزهرة، تم تطبيع القيم المتوسطة للمناطق ذات الأهمية إلى الفلورة التلقائية في الرئة من الفئران المصابة بالصورية وتم حساب التغييرات القابلة للطي. لتحليل الاستقرار الوراثي لBIRFLU في الجسم الحي، تم تحليل الفيروسات التي تم استردادها من الرئتين الفئران عن طريق فحص البلاك باستخدام المجهرية الفلورسنت (الزهرة، أعلى)، وتلطيخ المناعة (Nluc، الأوسط) والكريستال البنفسج تلطيخ (أسفل) (C). يتم عرض الصور التمثيلية من ماوس واحد. لتقييم النسخ المتماثل للفيروس، تم تجانس الرئتين بأكملها بعد التصوير واستخدامها لإصابة خلايا MDCK وتحديد التلكرالفيروسية عن طريق فحص البلاك (PFU/mL) (D). تشير الأسهم إلى وجود ارتباط بين الفلورة (الزهرة)، وتلطيخ المناعة (نلوك)، وتلطيخ البنفسج الكريستالي. القضبان تمثل يعني ± SD من titers فيروس الرئة. وقد تم تكييف هذا الرقم من Logales وآخرون55. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. وسائل الإعلام وحلول زراعة الأنسجة تكوين تخزين استخدام وسائل الإعلام ثقافة الأنسجة: دولبكو تعديل النسر المتوسط (DMEM)، 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 1٪ البنسلين-ستربيتوميسين-L-الجلوتامين (باريس سان جيرمان)(DMEM 10٪ FBS 1٪PSG). 445 مل DMEM، 50 مل من FBS و 5 مل من 100X PSG. 4 درجة مئوية صيانة خلايا MDCK وسائل الإعلام ما بعد العدوى:DMEM 0.3٪ الزلال البقري (BA)، 1٪ PSG (DMEM0.3٪ BA 1٪PSG). 491 مل DMEM، 4.2 مل من 35٪ BA و 5 مل من 100X PSG 4 درجة مئوية صيانة خلايا MDCK بعد العدوى الفيروسية 10x الفوسفات المخزنة المالحة المخزنة (PBS) 80 غرام من حمض الكلس، 2 غرام من كل شيء، 11.5 غرام من Na2HPO 4.7H2O، 2 غرام من KH2PO4. إضافة ddH2O تصل إلى 1 لتر ضبط الحموضة إلى 7.3 درجة حرارة الغرفة لإعداد 1X PBS 1x PBS تمييع 10X PBS مع ddH2س درجة حرارة الغرفة غسل الخلايا وسائل الإعلام العدوى: 1X PBS، 0.3٪ BA، 1٪ البنسلين-ستربينوميسين (PS) (PBS/ BA /PS). 487 مل 1x PBS معقمة، 4.2 مل من 35٪ BA و 5 مل من 100X 1٪ PS (100 U / مل) 4 درجة مئوية العدوى الفيروسية تثبيت / نفاذيبيليت الحل: 4٪ الفورمالديهايد، 0.5٪ تريتون X-100 المخففة في 1X PBS. 400 مل محايدة المخزنة الرسميين 10٪، 5 مل من تريتون X-100 و 595 مل من 1X PBS درجة حرارة الغرفة إصلاح ونفاذخلايا MDCK. حظر الحل: 2.5٪ البقري المصل الألبومين (BSA) في 1X PBS. 2.5 غرام من BSA في 97.5 مل من 1X PBS 4 درجة مئوية حل منع لمناعة واختبارات البلاك. محلول تخفيف الأجسام المضادة (1٪ BSA في 1X PBS) 1 غرام من BSA في 99 مل من 1X PBS 4 درجة مئوية تخفيف الأجسام المضادة الأولية والثانوية. 0.1٪ الكريستال البنفسجي الحل 1 غرام من البنفسج الكريستال في 400 مل من الميثانول. إضافة 600 مل من ddH2O درجة حرارة الغرفة تلطيخ خلايا MDCK في اختبار البلاك. التربسين المعالج بالتين Tosylsulfonyl فينيل ألانالان (TPCK) إعداد محلول مخزون 1000x في 1 ملغ / مل في ddH2O -20 درجة مئوية للعدوى الفيروسية. الجدول 1: وسائط وحلول ثقافة الأنسجة.
Discussion
اعتمد الباحثون على الفيروسات المؤتلفة التي تعبر عن المراسل كأدوات جزيئية حيوية لفهم وتوسيع الفهم الحالي للتكرار الفيروسي ومسببات الأمراض26،27،28، 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54-والجينات الأكثر تفضيلاً للمراسل هي اللوسيفيرات والبروتينات الفلورية، ويرجع ذلك أساساً إلى التقدم التكنولوجي في تحديدها، وتطوير المتغيرات المحسنة، والكشف عن طريق تقنيات التصوير43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48.وغالبا ما تستخدم الفيروسات مراسل المؤتلف لتسريع الاختبارات الفيروسية، ودراسة ديناميات الفيروسات في المختبر وفي الجسم الحي، واختبار فعالية المعتمدة حاليا أو الجديدة لقاح والنهج العلاجية26، 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36،37،38،39،40،41،54. لسوء الحظ، في حالة IAV، اقتصرت الدراسات السابقة على التعبير عن جين مراسل واحد، مما يعوق نوع الدراسة التي يمكن إجراؤها 26،27،28،29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54.لتجنب هذا القيد، قمنا بإنشاء IAV ثنائي المراسل المختصة بالنسخ المتماثل الذي يعبر عن لوسيفيراز نلوك وبروتين الفلورسنت فينوس (BIRFLU).
في هذا التقرير، نقوم بوصف التوصيف في المختبر من BIRFLU والنهج التجريبية لاستخدام BIRFLU لتتبع العدوى الفيروسية في الجسم الحي باستخدام نموذج الماوس من عدوى IAV. [بيرفلو] [نلوك] و [فنوس] يرتبط تعبير مع [تيترز] فيروسيّة. وبالإضافة إلى ذلك، ظلت بيرفلو مستقرة واستمرت في التعبير عن كل من جينات المراسلين بعد شفائهما من رئتي الفئران المصابة. ويتيح هذا النهج للباحثين فرصة ممتازة لدراسة المركبات المضادة للمركبات في الخلايا المستزرعة وفي النماذج الحيوانية، بما في ذلك تحديد وتطوير بدائل علاجية جديدة لعلاج العدوى بالمركبات المضادة للمركبات.
وعلى الرغم من أنه تم إنشاء BIRFLU باستخدام العمود الفقري لPR8، يمكن توليد أي AV مؤتلف آخر باستخدام نوع مختلف أو نوع فرعي أو العمود الفقري للسلالة الفيروسية باستخدام نفس النهج التجريبي. وبالمثل، وصفنا في هذا التقرير الإجراءات التجريبية لاستخدام BIRFLU في نموذج الماوس من IAV. ومع ذلك، يمكن أن تكون BIRFLU تكنولوجيا قيمة لتقييم عدوى المركبات المضادة للمركبات في النماذج الحيوانية الأخرى.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم تمويل البحوث المتعلقة بفيروس الأنفلونزا في مختبر LM-S جزئياً من قبل مركز نيويورك للتميز للإنفلونزا (NIH 272201400005C)، وهو عضو في مركز التميز في أبحاث الأنفلونزا ومراقبتها (CEIRS) رقم. HHSN272201400005C (NYICE) ومن قبل وزارة الدفاع (وزارة الدفاع) استعراض الأقران برنامج البحوث الطبية (PRMRP) منحة W81XWH-18-1-0460.
Materials
| 12-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 665102 | |
| 24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| Adobe Photoshop CS4 | Adobe | This software is used in 3.1.10 and 4.4.7 | |
| Bovin Albumin solution (BA) | Sigma-Aldrich | A7409 | Store at 4° C |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4 °C |
| Cell Culture dishes 100mm | Greiner Bio-one | 664-160 | |
| ChemiDoc MP Imaging System | BioRad | This instrument is used in 4.4.7 | |
| Crystal Violet | Thermo Fisher Scientific | C581-100 | Store at Room temperature |
| Dounce Tissue Grinders | Thomas Scientific | 7722-7 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20 °C |
| Five- to seven-week-old female BALB/c mice | National Cancer Institute (NCI) | 555 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Store at Room temperature |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) |
| IX81 Motorized Inverted Microscope | Olympus | Olympus IX81 | |
| Living Image 4.7.2 software | PerkinElmer | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) | |
| Lumicount | Packard | This instrument is used for quantifying luciferase activity (3.2.6) | |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells | ATCC | CCL-34 | |
| Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 | ATCC | H16-L10-4R5 | Store at -20 °C |
| Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C |
| Neutral Buffered Formalin 10% | EMD | 65346-85 | Store at RT |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo Fisher Scientific | 269620 | |
| Penicillin/Streptomycin (PS) 100x | Corning | 30-00-CI | Store at -20 °C |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Store at -20 °C |
| Retiga 20000R Fast1394 Camera | Qimaging | Retiga 2000R | |
| Scanner | HP | ||
| Texas Red-conjugated anti-mouse -rabbit secondary antibodies | Jackson | 715-075-150 | Store at -20 °C |
| Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Store at -20 °C |
| Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at RT |
| Vmax Kinetic plate reader | Molecular Devices |
Riferimenti
- Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication. Fields Virology. , (2007).
- Martinez-Sobrido, L., Peersen, O., Nogales, A. Temperature Sensitive Mutations in Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complex Responsible for the Attenuation of the Live Attenuated Influenza Vaccine. Viruses. 10 (10), (2018).
- Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetics Approaches for the Development of Influenza Vaccines. International Journal of Molecular Sciences. 18 (1), (2016).
- Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
- Louie, J. K., et al. A review of adult mortality due to 2009 pandemic (H1N1) influenza A in California. PLoS One. 6 (4), e18221 (2011).
- Barr, I. G., et al. Epidemiological, antigenic and genetic characteristics of seasonal influenza A(H1N1), A(H3N2) and B influenza viruses: basis for the WHO recommendation on the composition of influenza vaccines for use in the 2009-2010 Northern Hemisphere season. Vaccine. 28 (5), 1156-1167 (2010).
- Simonsen, L., et al. Impact of influenza vaccination on seasonal mortality in the US elderly population. A.M.A. archives of internal medicine. 165 (3), 265-272 (2005).
- McLean, H. Q., Peterson, S. H., King, J. P., Meece, J. K., Belongia, E. A. School absenteeism among school-aged children with medically attended acute viral respiratory illness during three influenza seasons, 2012-2013 through 2014-2015. Influenza and Other Respiratory Viruses. 11 (3), 220-229 (2017).
- Principi, N., Esposito, S. Protection of children against influenza: Emerging problems. Human Vaccines and Immunotherapeutics. , 1-8 (2017).
- Falsey, A. R., Treanor, J. J., Tornieporth, N., Capellan, J., Randomized Gorse, G. J. double-blind controlled phase 3 trial comparing the immunogenicity of high-dose and standard-dose influenza vaccine in adults 65 years of age and older. Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 172-180 (2009).
- Fuller, J. D., et al. Influenza vaccination of human immunodeficiency virus (HIV)-infected adults: impact on plasma levels of HIV type 1 RNA and determinants of antibody response. Clinical Infectious Diseases. 28 (3), 541-547 (1999).
- Carrat, F., Flahault, A. Influenza vaccine: the challenge of antigenic drift. Vaccine. 25 (39-40), 6852-6862 (2007).
- Doherty, P. C., Kelso, A. Toward a broadly protective influenza vaccine. Journal of Clinical Investigation. 118 (10), 3273-3275 (2008).
- Fiore, A. E., et al. Prevention and control of influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP), 2010. MMWR Recommendations and Reports. 59 (RR-8), 1-62 (2010).
- Pica, N., Palese, P. Toward a universal influenza virus vaccine: prospects and challenges. Annual Review of Medicine. 64, 189-202 (2013).
- To, K. K., Chan, J. F., Chen, H., Li, L., Yuen, K. Y. The emergence of influenza A H7N9 in human beings 16 years after influenza A H5N1: a tale of two cities. Lancet Infectious Diseases. 13 (9), 809-821 (2013).
- Baker, S. F., Nogales, A., Santiago, F. W., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Competitive detection of influenza neutralizing antibodies using a novel bivalent fluorescence-based microneutralization assay (BiFMA). Vaccine. 33 (30), 3562-3570 (2015).
- He, W., Mullarkey, C. E., Miller, M. S. Measuring the neutralization potency of influenza A virus hemagglutinin stalk/stem-binding antibodies in polyclonal preparations by microneutralization assay. Methods. , (2015).
- Kayali, G., et al. Testing human sera for antibodies against avian influenza viruses: horse RBC hemagglutination inhibition vs. microneutralization assays. Journal of Clinical Virology. 43 (1), 73-78 (2008).
- Stephenson, I., et al. Reproducibility of serologic assays for influenza virus A (H5N1). Emerging Infectious Diseases. 15 (8), 1252-1259 (2009).
- Maher, J. A., DeStefano, J. The ferret: an animal model to study influenza virus. Lab Animal (NY). 33 (9), 50-53 (2004).
- Webster, R. G., Cox, N., Stoehr, K. . WHO/CDS/CSR/NCS/2002.5 Rev. 1. , (2002).
- Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Cox, A., Baker, S. F., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L., Dewhurst, S. Development of a mouse-adapted live attenuated influenza virus that permits in vivo analysis of enhancements to the safety of live attenuated influenza virus vaccine. Journal of Virology. 89 (6), 3421-3426 (2015).
- Steel, J., Lowen, A. C., Mubareka, S., Palese, P. Transmission of influenza virus in a mammalian host is increased by PB2 amino acids 627K or 627E/701N. PLoS Pathogens. 5 (1), e1000252 (2009).
- Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).
- Fukuyama, S., et al. Multi-spectral fluorescent reporter influenza viruses (Color-flu) as powerful tools for in vivo studies. Nature Communications. 6, 6600 (2015).
- Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (25), 11531-11536 (2010).
- Perez, J. T., Garcia-Sastre, A., Manicassamy, B. Insertion of a GFP reporter gene in influenza virus. Current Protocols in Microbiology. , (2013).
- Reuther, P., et al. Generation of a variety of stable Influenza A reporter viruses by genetic engineering of the NS gene segment. Scientific Reports. 5, 11346 (2015).
- Tran, V., et al. Multi-Modal Imaging with a Toolbox of Influenza A Reporter Viruses. Viruses. 7 (10), 5319-5327 (2015).
- Breen, M., Nogales, A., Baker, S. F., Perez, D. R., Martinez-Sobrido, L. Replication-Competent Influenza A and B Viruses Expressing a Fluorescent Dynamic Timer Protein for In Vitro and In Vivo Studies. PLoS One. 11 (1), e0147723 (2016).
- Nogales, A., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. , 206-216 (2014).
- Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2015).
- Avilov, S. V., et al. Replication-competent influenza A virus that encodes a split-green fluorescent protein-tagged PB2 polymerase subunit allows live-cell imaging of the virus life cycle. Journal of Virology. 86 (3), 1433-1448 (2012).
- Breen, M., Nogales, A., Baker, S. F., Martínez-Sobrido, L. Replication-Competent Influenza A Viruses Expressing Reporter Genes. Viruses. 8 (7), (2016).
- Eckert, N., et al. Influenza A virus encoding secreted Gaussia luciferase as useful tool to analyze viral replication and its inhibition by antiviral compounds and cellular proteins. PLoS One. 9 (5), e97695 (2014).
- Karlsson, E. A., et al. Visualizing real-time influenza virus infection, transmission and protection in ferrets. Nature Communications. 6, 6378 (2015).
- Czako, R., et al. In Vivo Imaging of Influenza Virus Infection in Immunized Mice. MBio. 8 (3), (2017).
- Harding, A. T., Heaton, B. E., Dumm, R. E., Heaton, N. S. Rationally Designed Influenza Virus Vaccines That Are Antigenically Stable during Growth in Eggs. MBio. 8 (3), (2017).
- DiPiazza, A., et al. Pandemic 2009 H1N1 Influenza Venus reporter virus reveals broad diversity of MHC class II-positive antigen-bearing cells following infection in vivo. Scientific Reports. 7 (1), 10857 (2017).
- Yan, D., et al. Replication-Competent Influenza Virus and Respiratory Syncytial Virus Luciferase Reporter Strains Engineered for Co-Infections Identify Antiviral Compounds in Combination Screens. Biochimica. 54 (36), 5589-5604 (2015).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (Pt 24), 4247-4260 (2007).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Kelkar, M., De, A. Bioluminescence based in vivo screening technologies. Current Opinion in Pharmacology. 12 (5), 592-600 (2012).
- Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
- Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
- Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12 (7), 1-13 (2013).
- Vintersten, K., et al. Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals. Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).
- Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Mol Imaging. 12 (7), 1-13 (2013).
- Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (36), 14610-14615 (2012).
- Pan, W., et al. Visualizing influenza virus infection in living mice. Nat Commun. 4, 2369 (2013).
- Heaton, N. S., et al. In vivo bioluminescent imaging of influenza a virus infection and characterization of novel cross-protective monoclonal antibodies. J Virol. 87 (15), 8272-8281 (2013).
- Nogales, A., Baker, S. F., Martínez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. 476, 206-216 (2015).
- Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent Bi-Reporter influenza A virus (BIRFLU) to evaluate viral infections. Journal of Virology. , (2019).
- Nogales, A., et al. Influenza A Virus Attenuation by Codon Deoptimization of the NS Gene for Vaccine Development. Journal of Virology. 88 (18), 10525-10540 (2014).
- Nogales, A., DeDiego, M. L., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Rearrangement of Influenza Virus Spliced Segments for the Development of Live-Attenuated Vaccines. Journal of Virology. 90 (14), 6291-6302 (2016).
- National Research Council (U.S.). Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals., Institute for Laboratory Animal Research (U.S.) & National Academies Press (U.S.). . Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
- Nogales, A., Martinez-Sobrido, L., Chiem, K., Topham, D. J., DeDiego, M. L. Functional Evolution of the 2009 Pandemic H1N1 Influenza Virus NS1 and PA in Humans. Journal of Virology. 92 (19), (2018).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
Citazione di questo articolo
Chiem, K., Rangel-Moreno, J., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection. J. Vis. Exp. (150), e59890, doi:10.3791/59890 (2019).