Isolering af spyt Epiteliale celler fra humane spytkirtler til in vitro-vækst som Salisfærer eller Monolayers

I pattedyr spytkirtlerne er organiseret i 3 par store spytkirtler: den parotid, submandibulær, og sublinguale kirtler. Der findes også en række mindre kirtler placeret på tungen og spredt over hele mundhulen¹. De vigtigste kirtler er ansvarlige for bulk volumen af spyt produceret². Ud over at give antimikrobiel beskyttelse gennem udskillede faktorer, spyt er vigtigt i processen med at tygge og smøre fødevarer, som det passerer gennem spiserøret². Som sådan, spytkirtel dysfunktion repræsenterer en medicinsk problem, hvor syge, der er i stand til at producere nok spyt er mere tilbøjelige til at udvikle maladies såsom dental kaviteter eller oral candidiasis³. Desuden, reduceret spyt resulterer i større problemer med at spise og fordøje fødevarer har en betydelig indvirkning på livskvalitet.

Spytkirtel dysfunktion findes primært hos patienter, der lider af Sjögrens syndrom, en autoimmunsygdom eller hos patienter med hoved-og nakke kræft, som har gennemgået strålebehandling^{3,4,5, 6}. Beskadigede sekretoriske acini inden for kirtler som følge af autoimmunitet eller strålebehandling ikke undergår selvfornyelse, hvilket resulterer i en patient, der lever med uoprettelige skader⁶. Studiet af spytkirtler har også høstet opmærksomhed eller forskere interesseret i mekanismer af viral patogenese. Nogle patogener, såsom humant Cytomegalovirus (HCMV), vedholdende replikere inden for spytkirtlerne, som derefter giver mulighed for overførsel af spirende virus til en ny vært via spyt^7,8. Således er der en uopfyldt behov for at udvikle robuste og reproducerbare in vitro-modeller af spytkirtel væv til at tackle og forstå en bred vifte af medicinske problemer.

Flere modeller af murine spytkirtel system har været brugt som udgangspunkt for at forstå og karakterisere de forskellige epiteliale celler, der danner spytkirtlerne^9,10. Der findes indlysende og store forskelle mellem menneskelige og murine spytkirtler¹¹. Især den menneskelige parotideale kirtel er større i forhold til submandibulær kirtel, mens musens submandibulære og parotideale er meget ens i størrelse^1,2,11. Mens udødeliggjort menneskelige submandibulære cellelinjer findes, der er store bekymringer, at de udødeliggjort celler ikke præcist vedligeholde Fænotypen af det primære væv og sekundære bekymringer, at de udødelige celler ikke rent faktisk stammer fra spyt epitelet¹². Af disse grunde er der en interesse og et behov for at studere primære spyt væv fra mennesker.

Her beskriver vi en protokol for at isolere primære epiteliale celler fra menneskelige spytkirtler til vævskultur. Vores protokol er baseret på værker af Pringle et al. og Tran et al. med ændringer, der generelt forenkler deres procedurer^13,14. For det første, mens Tran et al. ‘s protokol kræver en lang femtimers inkubation for enzymatisk at fordøje spyt vævet, har vores modificerede protokol været vellykket med så lidt som en times inkubation, svarende til den i Pringle et al. For det andet bruger vi forskellige enzymer til vævs fordøjelse, især vi bruger ikke trypsin som bruges i den oprindelige Tran et al. protokol, men i stedet bruge en blanding af dispase og kollagenase. Vi foretrækker at undgå trypsin i de indledende fordøjelsestrin, da en nylig undersøgelse antydede, at den initiale fordøjelse af spyt vævet ved trypsin resulterer i nedsat cellelevedygtighed, muligvis ved tab af en sjælden stamcelle population¹⁵. Endelig kultur de salisfærer på overfladen af kælderen membran matrix (BMM) ved hjælp af en kommercielt tilgængelige medier oprindeligt formuleret til formering af bronkiale epitelceller. Vores protokol kan bruges til at isolere spyt celler fra parotid, submandibulær og sublinguale kirtler. Disse celler udtrykker spyt amylase og andre spyt specifikke gener, der indikerer, at de opretholder en fænotype svarende til spyt acinic epiteliale celler⁷. Vi har med succes genereret spyt kulturer fra > 50 primære humane vævsprøver ved hjælp af denne metode. Desuden kan de primære spyt celler nemt kryopreserveres til brug på et senere tidspunkt.