Vi præsenterer en metode til isolering og dyrkning af primære menneskelige spytkirtel-afledte epiteliale celler. Disse celler udviser genekspressions mønstre i overensstemmelse med dem, der er af spyt epitelial oprindelse og kan dyrkes som salisfærer på kælder membran matricer afledt af Engelbreth-Holm-sværm tumorceller eller som monolag på behandlede kultur retter.
Spytkirtlerne er et sted af betydelig interesse for forskere, der er interesseret i flere aspekter af sygdomme hos mennesker. Et mål for forskere er at genoprette funktionen af kirtler beskadiget af stråling behandlinger eller på grund af patologier forbundet med Sjögrens syndrom. Et andet mål for forskere er at definere de mekanismer, hvormed vira replikere inden for glandulær væv, hvor de kan derefter få adgang til spyt væsker vigtigt for horisontal transmission. Disse mål fremhæver behovet for en robust og tilgængelig in vitro spytkirtel model, der kan udnyttes af forskere interesseret i ovennævnte samt relaterede forskningsområder. Her diskuterer vi en simpel protokol for at isolere epiteliale celler fra menneskelige spytkirtler og udbrede dem in vitro. Vores protokol kan optimeres yderligere for at imødekomme behovene i de enkelte undersøgelser. Kort sagt er spyt vævet mekanisk og enzymatisk adskilt for at isolere enkeltceller eller små klynger af celler. Udvælgelse til epiteliale celler sker ved plating på en kælder membran matrix i nærværelse af medier optimeret til at fremme epitel cellevækst. Disse resulterende kulturer kan opretholdes som tredimensionelle klynger, kaldet “salisfærer”, eller dyrkes som en enkeltlags på behandlede plastik væv kultur retter. Denne protokol resulterer i en udvækst af en heterogene population af hovedsageligt epiteliale celler, der kan overføres til 5-8 passager (15-20 population doublings) før undergår cellulære senescens.
I pattedyr spytkirtlerne er organiseret i 3 par store spytkirtler: den parotid, submandibulær, og sublinguale kirtler. Der findes også en række mindre kirtler placeret på tungen og spredt over hele mundhulen1. De vigtigste kirtler er ansvarlige for bulk volumen af spyt produceret2. Ud over at give antimikrobiel beskyttelse gennem udskillede faktorer, spyt er vigtigt i processen med at tygge og smøre fødevarer, som det passerer gennem spiserøret2. Som sådan, spytkirtel dysfunktion repræsenterer en medicinsk problem, hvor syge, der er i stand til at producere nok spyt er mere tilbøjelige til at udvikle maladies såsom dental kaviteter eller oral candidiasis3. Desuden, reduceret spyt resulterer i større problemer med at spise og fordøje fødevarer har en betydelig indvirkning på livskvalitet.
Spytkirtel dysfunktion findes primært hos patienter, der lider af Sjögrens syndrom, en autoimmunsygdom eller hos patienter med hoved-og nakke kræft, som har gennemgået strålebehandling3,4,5, 6. Beskadigede sekretoriske acini inden for kirtler som følge af autoimmunitet eller strålebehandling ikke undergår selvfornyelse, hvilket resulterer i en patient, der lever med uoprettelige skader6. Studiet af spytkirtler har også høstet opmærksomhed eller forskere interesseret i mekanismer af viral patogenese. Nogle patogener, såsom humant Cytomegalovirus (HCMV), vedholdende replikere inden for spytkirtlerne, som derefter giver mulighed for overførsel af spirende virus til en ny vært via spyt7,8. Således er der en uopfyldt behov for at udvikle robuste og reproducerbare in vitro-modeller af spytkirtel væv til at tackle og forstå en bred vifte af medicinske problemer.
Flere modeller af murine spytkirtel system har været brugt som udgangspunkt for at forstå og karakterisere de forskellige epiteliale celler, der danner spytkirtlerne9,10. Der findes indlysende og store forskelle mellem menneskelige og murine spytkirtler11. Især den menneskelige parotideale kirtel er større i forhold til submandibulær kirtel, mens musens submandibulære og parotideale er meget ens i størrelse1,2,11. Mens udødeliggjort menneskelige submandibulære cellelinjer findes, der er store bekymringer, at de udødeliggjort celler ikke præcist vedligeholde Fænotypen af det primære væv og sekundære bekymringer, at de udødelige celler ikke rent faktisk stammer fra spyt epitelet12. Af disse grunde er der en interesse og et behov for at studere primære spyt væv fra mennesker.
Her beskriver vi en protokol for at isolere primære epiteliale celler fra menneskelige spytkirtler til vævskultur. Vores protokol er baseret på værker af Pringle et al. og Tran et al. med ændringer, der generelt forenkler deres procedurer13,14. For det første, mens Tran et al. ‘s protokol kræver en lang femtimers inkubation for enzymatisk at fordøje spyt vævet, har vores modificerede protokol været vellykket med så lidt som en times inkubation, svarende til den i Pringle et al. For det andet bruger vi forskellige enzymer til vævs fordøjelse, især vi bruger ikke trypsin som bruges i den oprindelige Tran et al. protokol, men i stedet bruge en blanding af dispase og kollagenase. Vi foretrækker at undgå trypsin i de indledende fordøjelsestrin, da en nylig undersøgelse antydede, at den initiale fordøjelse af spyt vævet ved trypsin resulterer i nedsat cellelevedygtighed, muligvis ved tab af en sjælden stamcelle population15. Endelig kultur de salisfærer på overfladen af kælderen membran matrix (BMM) ved hjælp af en kommercielt tilgængelige medier oprindeligt formuleret til formering af bronkiale epitelceller. Vores protokol kan bruges til at isolere spyt celler fra parotid, submandibulær og sublinguale kirtler. Disse celler udtrykker spyt amylase og andre spyt specifikke gener, der indikerer, at de opretholder en fænotype svarende til spyt acinic epiteliale celler7. Vi har med succes genereret spyt kulturer fra > 50 primære humane vævsprøver ved hjælp af denne metode. Desuden kan de primære spyt celler nemt kryopreserveres til brug på et senere tidspunkt.
Spyt dysfunktion repræsenterer en bekymring for livskvaliteten for dem, der lider af Sjögrens syndrom samt dem, der gennemgår strålebehandling for kræft ved siden af spytkirtlerne3,4,5, 16. En foreslået terapi til behandling af disse patienter er at dyrke funktionelle spyt celler eller organoider in vitro, som derefter kan indsættes i beskadigede spytkirtel til at erstatte angrebne væv…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke James P. Bridges for at give en betydelig vejledning om de metoder, der er involveret i dyrkning af primære celler. Matthew J. Beucler blev støttet af nationale institutter for sundhedsuddannelse Grant T32-ES007250. Dette arbejde blev også støttet af nationale institutter for sundhedstilskud R01-AI121028 og R21-DE026267 tildelt William E. Miller.
100 mm culture dishes | Thermo Scientific | 172931 | |
15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339653 | |
Bronchial Epithelial Cell Growth Media | Lonza | CC-3171 | Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum. |
Cell strainer 70 µm nylon mesh | Fisher | 22-363-548 | |
Charcoal stripped fetal bovine serum | Gibco | 12676-029 | |
Collagenase type III | Worthington | LS004182 | Store at 4 °C. |
Cryogenic Tube | Fisher | 5000-0020 | |
Dispase | Cell Applications | 07923 | Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C. |
Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
Dulbecco phosphate buffered saline | Corning | 55-031-PC | |
General Chemicals | Sigma | ||
PathClear Basement membrane extract | Cultrex | 3432-005-01 | Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice. |
Six-well culture dishes | Falcon | 353046 | |
Surgical forceps | Fisher | 22-079-742 | |
Trypsin-EDTA solution | Corning | 25-052-CI |