Onderzoek van de kern dynamiek van de mitotische en Meiotische splijtstof gist door fluorescentie-Live-cel microscopie

1. Media voorbereiding15,16 Stock oplossingen Bereid een 50x zout voorraadoplossing door toevoeging van 52,5 g MgCl2· 6h20, 0,735 g CACL2· 2H20, 50 g KCl en 2 g na2S04 in een fles met 1 L gedistilleerd water. Meng de oplossing grondig en steriliseren door filtratie. Plaats bij 4 °C voor lange termijn opslag. Maak een 1, 000x vitamine voorraadoplossing door 1 g Pantotheenzuur te mengen, 10 g nicotinezuur, 10 g inositol en 10 mg Biotine in een fles met 1 L gedistilleerd water. Meng de oplossing goed en steriliseren door filtratie. Bewaren bij 4 °C voor lange termijn opslag. Bereid een 10, 000x minerale stamoplossing door 5 g boorzuur toe te voegen, 4 g MnSO4, 4G znso4· 7h2o, 2 g fecl2· 6h2o, 1 g ki, 0,4 g molybdeen zuur, 0,4 g van CuSO4· 5H20 en 10 g citroenzuur in een fles met 1 L gedistilleerd water. Meng de oplossing grondig en steriliseren door filtratie. Plaats bij 4 °C voor lange termijn opslag. Maak individuele nutriënt voorraadoplossingen door 7,5 g adenine, Leucine, histidine of lysine toe te voegen aan een fles met 1 L gedistilleerd water. Gebruik slechts 3,75 g om de uracil-oplossing te maken. Steriliseer oplossingen door autoclaven.Opmerking: Na verloop van tijd, uracil neerdringt uit de oplossing. Om weer in de oplossing te brengen, warm in de magnetron op 60% vermogen in stappen van 10 s of plaats in een waterbad van 55 °C gedurende 20 min. Draai de warme oplossing om totdat alle uracil klonters verdwijnen. Gistextract plus supplementen (Ja) Voeg in een kolf van 2 L 1 L gedistilleerd water toe, 5 g gistextract Base, 30 g glucose en 225 mg elk van adenine, uracil, L-histidine, L-leucine en L-lysine. Voeg 20 g agar toe om het vaste medium te maken. Gebruik een magnetische roerstaaf om ingrediënten volledig op te lossen in de oplossing. Agar zal smelten nadat het medium gesteriliseerd is door autoclaven.Opmerking: Voor het gemak is gebruiksklare ja poeder ook commercieel beschikbaar. Edinburgh minimal medium (EMM) en pombe glutamaat medium (PMG) Combineer in een kolf van 2 L 1 L gedistilleerd water met 3 g kalium waterstof ftalaat, 2,2 g na2HPO4, 5 g NH4cl, 20 g glucose, 20 mL zoutvoorraad oplossing, 1 ml vitamine voorraadoplossing en 0,1 mL minerale voorraadoplossing. Vervang NH4Cl met 2,2 g L-glutaminezuur Mononatrium zout om PMG te bereiden. Voeg 20 g agar toe om het vaste medium te maken. Gebruik een magnetische roerstaaf en los de ingrediënten grondig op. Agar zal smelten nadat het medium gesteriliseerd is door autoclaven. Voeg voor gebruik indien nodig nutriënt voorraadoplossingen toe. Voor elke 1 L medium, voeg 15 mL elk van adenine, Leucine, histidine, en lysine. Gebruik 30 mL voor uracil, omdat het minder geconcentreerd is dan de andere voedingsoplossingen.Opmerking: Voor het gemak zijn ook kant-en-klare EMM-en PMG-poeders in de handel verkrijgbaar. Moutextract (ME) Gebruik een kolf van 2 liter om 1 L gedistilleerd water te mengen met 30 g moutextract en 225 mg elk van adenine, uracil, histidine en leucine. Stel de pH in op 5,5. Neem 20 g agar om het vaste medium te maken. Los componenten op in de oplossing met behulp van een magnetische roerstaaf. Agar zal smelten nadat het medium gesteriliseerd is door autoclaven. Sporulatie agar met supplementen (kuuroorden) Voeg in een kolf van 2 L 1 L gedistilleerd water toe, 10 g glucose, 1 g KH2po4, 1 ml vitamine voorraad, 45 mg elk van adenine, uracil, histidine, leucine en lysine hydrochloride. Voeg 20 g agar toe om het vaste medium te maken. Gebruik een magnetische roerstaaf om ingrediënten grondig te combineren. Agar zal smelten nadat het medium gesteriliseerd is door autoclaven. 2. splijting gistcultuur15,16 Gebruik YES Solid medium om de giststammen van de fissie te wekken van cryogeen conservering. Afhankelijk van de temperatuurvereisten van elke stam, incuberen bij 25 °C of 32 °C gedurende 3-5 dagen. Wanneer kolonies zichtbaar zijn, bereidt u een start vloeistof cultuur voor. Kies cellen uit individuele kolonies en inoculeren ze in reageerbuisjes met 3 mL ja vloeibaar medium. Groei op de juiste temperatuur naar de mid-of late-log fase.Opmerking: Gebruik voor de juiste beluchting buizen of kolven met een volume van ten minste 5x groter dan het beoogde Trillingssnelheden tussen 150-220 rpm zijn gebruikelijk voor routine cultuur groei. Verdeel 250-500 μL van de starter cultuur in een kolf van 50 mL die 9,5-9.75 mL Ja, EMM of PMG plus passende supplementen bevat. Laat cellen groeien tot de gewenste dichtheid en controleer onder de Microscoop op de juiste celmorfologie en voedingstoestand.Opmerking: Voor het opslaan van ontwaakt stammen voor maximaal een maand, Seal ja platen met paraffine tape en plaats bij 4 ° c. 3. monstervoorbereiding2 Microscoop-dia instellen Voeg 2 g agarose toe in een bekerglas van 500 mL met 100 mL van ofwel minimale medium plus supplementen (mitose) of vloeibare kuuroorden (meiose). Verwarm de agarose-oplossing in een magnetron met een vermogen van 60% in stappen van 10 sec. of plaats in een waterbad van 55 °C gedurende 10 min. zwenk de oplossing om efficiënt smelten te garanderen. Bereid de agarose Slide-Making opstelling (Figuur 1a) voor om de snelle pad voorbereiding te garanderen en voorkom dat gesmolten agarose voortijdig stollen. Laat de gesmolten agarose gedurende 1 minuut afkoelen bij kamertemperatuur en breng 50-100 μL vlekken op de Microscoop glaasjes aan met behulp van pipetpunten met een brede boring. Voordat de agarose afkoelt, plaatst u een Microscoop-dia op de bovenkant om een spread pad van ongeveer 1,5-2 cm in diameter te genereren (Figuur 1b-C). De breedte van het agarose-pad is meestal evenredig aan de lengte van de beeldvormings tijd. Met andere woorden, dikkere pads zijn bestand tegen langere beeldvormings perioden. Gebruik een koolwaterstof mengsel als een afdichtmiddel om te zorgen voor een juiste dekking van dia’s met dikke agarose pads en om celdood te voorkomen van oplosmiddel blootstelling aan de afdek randen. Meng gelijke delen (w/w) van Petroleum gelei, lanoline en paraffine in een bekerglas van 500 mL. Verwarm de ingrediënten op een hete plaat bij 120 °C gedurende 5 minuten. Als onderdelen smelten, zwenk voorzichtig de gesmolten oplossing om te zorgen voor een juiste menging. Voorbeeld van Setup Voor het onderzoek van mitotische gebeurtenissen, groeien cellen uit starter culturen in vloeibare EMM of PMG plus aanvullingen op ongeveer halverwege log fase (OD595 van 0,4). Centrifuge 1 mL van de celsuspensie bij 1.375 x g gedurende 1 minuut, verwijder het supernatant en regeer de celpellet in het minimale medium plus supplementen tot een eindvolume van 100 μL. Voor het beeld van de Meiotische gebeurtenissen, groeien cellen uit starter culturen in de minimale medium plus aanvullingen op de fase van de late log (OD595 van 0.7-1.0). Combineer gelijke volumes van tegengestelde type cellen (h- en h+) in een 1 ml celsuspensie. Centrifugeer cellen bij 1.375 x g gedurende 1 minuut en hervat de pellet in Liquid me. Herhaal deze stap driemaal om te zorgen voor efficiënte nutriënten verwijdering. Na de laatste mij wassen, respendeer cellen in 1 mL van mij en voeg het toe aan een kolf van 50 mL met 9 mL ME. Inincuberen voor 12-16 uur bij 22-25 °C op minimale rotatiesnelheid (50-100 RPM). Overvloedige celflocculatie, wat resulteert in veel ronde splijting gist klonters en duidt op efficiënte paring. Neem 1 mL monster van de parings cultuur en Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 1.375 x g . Elimineer het supernatant maar laat 250 μL in de buis om cellen te respenderen. Voor het plaatsen van cellen op agarose pads, Vortex krachtig voor 5 s om klonters te verstoren.Opmerking: De resterende 250 μL die ik gebruikte om cellen te respenderen bevat parings factoren die de cellen helpen om meiosis in te voeren. Plaats 20 μL van ofwel een mitotische of Meiotische celsuspensie op een 2% agarose pad. Verwijder het overtollige medium door de dia te inverteren en op de bovenkant van een pluisvrije papieren handdoek voor 2-3 s (afbeelding 1d) te plaatsen. Zet de schuif kant naar boven en plaats een glazen afdekplaat voorzichtig, zodat er geen luchtbelletjes ontstaan (Figuur 1f).Opmerking: Het elimineren van overtollig medium met een papieren handdoek is meer tijd-efficiënt dan zwaartekracht absorptie, wat bijzonder belangrijk is bij meiose-experimenten. Om een monolayer van een cel te maken, draait u de Afdeklijst rechtsom met de wijsvinger voor één (mitose) of twee (meiosis) volle bochten (Figuur 1f). Zorg ervoor dat de celstof verspreidt over de agarose pad waardoor een betere scheiding van afzonderlijke cellen of ASCI. Met behulp van een kleine houten stok, doseren gesmolten Sealant langs de randen van de dekslip om elk agarose pad te verzegelen (figuur 1g). Zodra het agarose pad is verzegeld, plaatst u het op de Microscoop en laat u het gedurende 10-15 minuten op de juiste beeldvormings condities (bijv. temperatuur) (afbeelding 1h) plaatsen om luchtbelletjes te laten afvoeren en eventuele veranderingen in het laatste moment van de agarose te laten plaatsvinden. Begin met Imaging zodra de dia efficiënt is geëscaleerd en verwijder deze niet uit het werkgebied totdat het verzamelen van gegevens is beëindigd.Opmerking: Controle van de temperatuur en vochtigheid wordt bepaald door het gebruikte Microscoop systeem en specifieke experimentele eisen. Indien aanwezig, past u de temperatuur-en vochtigheidsregeling toe op alle beeldvormings experimenten. Als ze afwezig zijn, moeten onderzoekers een manier bedenken om temperatuurschommelingen te voorkomen, vooral tijdens meiose-experimenten. 4. Live-Cell Imaging2 en processing Gebruik de 40x-doelstelling om de juiste kijk velden naar de afbeelding te vinden. Schakel over naar de 60x-doelstelling om gegevens te verzamelen. Afhankelijk van het gebruikte Microscoop systeem zullen de daaropvolgende refocussering en het snijden op elk moment van het monster handmatig of via een microscoop-of softwaregeautomatiseerd proces plaatsvinden.Opmerking: De beelden in dit protocol werden verzameld met behulp van een deconvolutie, fluorescentie Microscoop uitgerust met Sedat, RFP en GFP filter sets, nano-Motion stage, 60x NA 1,4 objectief lens, en 12-bit CCD camera. Ingebouwde mechanische rolluiken en gemotoriseerde filter wielen toegestaan voor de verminderde excitatie blootstelling en fotobleaching van monsters. Gebruik de juiste software om afbeeldingen te verkrijgen en te verwerken. Om afbeeldingen te deconvolve, gebruik van door de fabrikant geleverde optische overdrachtsfuncties.Opmerking: Raadpleeg de tabel met materialenvoor meer informatie over de Microscoop-apparatuur en software die in dit protocol wordt gebruikt. Om een conventionele fluorescentiemicroscoop te gebruiken om live-celbeelden te verkrijgen, zorgt u ervoor dat de Microscoop gegevens digitaal verzamelt, heeft 40x of 60x doelstellingen met numerieke diafragma’s (NA) groter dan 1,2, en is in staat om optische snijden uit te voeren.Opmerking: Zonder deze vereisten zullen afbeeldingen een gereduceerde resolutie vertonen, wat de kwaliteit van microscopische metingen en kwalitatieve waarnemingen in gevaar brengt. Gebruik gratis plug-in-programma’s (bijvoorbeeld Fiji) om systematische vervagings fouten te minimaliseren die voortvloeien uit het contrast verlies tijdens de beeld verwerving17,18,19,20 en om een juiste kwantitatieve analyse te garanderen van de intensiteit van de fluorescentie en van andere tijdelijke en dynamische gebeurtenissen in de cel.Opmerking: Andere beschikbare commerciële deconvolutie Programma’s zijn te vinden in de tabel van de materialen. Kies de Microscoop filter sets die het best overeenkomen met de fluorohores onder observatie. Zorg ervoor dat de excitatie-en emissie filters de juiste band passen hebben die de specifieke detectie van fluorescerende eiwitten mogelijk maken. Om bijvoorbeeld het GVB-signaal te detecteren, is een excitatie-en emissie band-pas van 430/25 en 470/30 geschikt, maar niet voor de fluorescentie van RFP. Gebruik een minimaal-effectieve-instellingenbenadering (MESA) bij het uitbeelden van splijtings gist op meerdere tijdstippen. Met andere woorden, Vermijd langdurig gebruik van excitatie golflengten en gebruik het laagste excitatie vermogen en de blootstellingstijd die acceptabele, maar kwantificeerbare en reproduceerbaar beeldvormings gegevens genereren. Voor langdurige beeldvorming tijdens mitose of meiose, beperk het interval tussen de acquisitie tijdpunten tot 5-10 min. Hoewel 2% agarose pads kunnen weerstaan 12 tot 16 h Imaging sessies, celverschuiving als gevolg van agarose verdamping is waarschijnlijk. Voer daarom volledige mitose-of meiosisexperimenten uit in respectievelijk 4-6 h-of 8-10 h-Vensters. Verzamel beeldgegevens voor 4-8 h bestaande uit ten minste 24-48 acquisitie tijdpunten, respectievelijk één fluorescentie proteïne, en een z-stack per tijdspunt en fluorescerende kanaal bestaat uit 13 secties met 0,5-μm afstand met behulp van een 60x-doelstelling. Hiervoor is ten minste 0,5-1 GB opslagruimte op de harde schijf vereist. Dus, naast het elimineren van photobleaching en celverschuiving, maak een workflow die rekening houdt met computercapaciteiten1,2,3.Opmerking: Deze acquisitie parameters worden meestal ingesteld en gewijzigd in de software die de Microscoop functies regelt en die afbeeldingen verzamelt en verwerkt. Om specifieke nucleaire processen nader te bestuderen, voert u elke 5-10 s Image Acquisition uit, zolang de emissie na frequente blootstelling niet substantieel afneemt. Voer een voorlopige analyse van de fluorescentie intensiteit uit gedurende verschillende tijdsperioden om het punt te bepalen waarna de juistheid van de verzamelde gegevens niet langer betrouwbaar is,1,3. Gebruik in de software voor het verzamelen en het verwerken van afbeeldingen maximale intensiteit projectie op de afbeelding z-stacks om alle structuren met een hoge fluorescentie dichtheid op een 2D-vlak te observeren, ongeacht hun verticale locatie1,2, 3. Dit vergemakkelijkt een snel onderzoek van nucleaire processen die zich voordoen in verschillende voxels. Verzamel een mid-focale helder-veld afbeelding om een referentiebeeld van de cellen onder observatie te genereren. 5. imageanalysis20,21 Opmerking: Beeldanalyse in dit protocol wordt uitgevoerd met behulp van Fiji. Voor andere analyseprogramma’s en Fiji-invoegtoepassingen Zie tabel met materialen. Upload een gedeconvolved afbeelding door de importfunctie voor bio-indelingen te selecteren in het menu plugins . Selecteer in het pop-upvenster import opties de optie Hyper stack, standaardkleur modusen controleer automatisch schalen voordat u op de knop OK drukt. Zorg ervoor dat het weergegeven venster het juiste aantal fluorescentie kanalen en tijdframes heeft door opzij te schuiven op de respectievelijke staven onderaan. Opslaan als een TIFF-bestand, dat geen gegevens comprimeert en informatieverlies voorkomt. Open een afbeelding met een schaalbalk die is gegenereerd tijdens de gegevensverwerking door de Microscoop-software. Bepaal de pixellengte van de schaalbalk met behulp van het gereedschap rechte lijn om een parallelle lijn van vergelijkbare grootte te tekenen en selecteer meten in het menu analyseren. Voeg een schaalbalk toe door de pixel-naar-μm-verhouding in te stellen door schaal instellen te selecteren in het menu analyseren. In het pop-upvenster schaal instellen , voert u de berekende afstand in pixels en bekende afstand in μmin, stelt u de pixel verhouding in op 1,0, plaatst u micron als de lengte-eenheiden controleert u het algemene vak voordat u op de OK knop. Gebruik de optie metingen instellen onder het menu analyseren om verschillende parameters te kiezen om te kwantificeren bij het selecteren van meting. Voor de toepassing van dit protocol, selecteer de volgende metrische gegevens: gebied, omtrek, gemiddelde grijswaarde, mediaan, Min & Max grijswaarde, geïntegreerde dichtheid, stack positie, en weergave Label. Afhankelijk van de precisie van de verzamelde gegevens, voer meer dan 1 voor de decimale plaatsen optie en controleer de wetenschappelijke notatie vak indien nodig. Na het toepassen van de opdracht Measure worden in een pop-upvenster met resultaten de waarden voor elke relevante parameter weergegeven. Sla de resultaten op als CSV-bestand voor toekomstige analyse in een Statistiekprogramma.Opmerking: Het is niet nodig om een afbeelding in de samenstellende fluorescerende kanalen te scheiden om de lengte te bepalen, tenzij er signaalinterferentie is tussen de verschillende kleuren in welk geval de onderstaande stap volgt. In het geval van signaalstoring, Selecteer kleur en kanalen gereedschap in het menu afbeelding en analyseer elke kleur afzonderlijk. Als u de lengte van niet-lineaire structuren wilt meten, klikt u met de rechtermuisknop op het gereedschap lijn en gebruikt u de optie gesegmenteerde lijn of vrije Handlijn om de gewenste objecten te traceren. Voor lineaire structuren of om de afstand tussen twee punten te bepalen, gebruikt u de functie voor rechte lijnen en selecteert u meten in het menu analyseren . Waarden voor lengte in μm worden automatisch toegevoegd aan de parameters die eerder zijn geselecteerd onder de optie metingen instellen . Voor het meten van veranderingen in de signaal grootte en de intensiteit van de fluorescentie, maakt u eerst een regio van belang (ROI)-bibliotheek, die de kwantificerings nauwkeurigheid verhoogt en snelle metingen in een afbeeldingsstapel vergemakkelijkt. Selecteer het gereedschap kleur en kanalen onder het menu afbeelding . Controleer in het pop-upvenster kanalen het kleurkanaal waarvoor de intensiteit of het gebied wordt gemeten. Kies de functies aanpassen en drempel in het menu afbeelding . Controleer de donkere achtergrond vak, selecteer de standaard methode (tenzij anders vereist door de verzamelde gegevens) en kies rood om de signalen van belang te bedekken.Opmerking: Meting van de stabiliteit van eiwitten, beweging en lokalisatie zijn nauw afhankelijk van de kleur drempel die wordt gebruikt voor het maken van ROI-bibliotheken. Het is belangrijk om de juiste drempelmethode te kiezen voor het type fluorescerende marker signaal dat wordt gevisualiseerd17,18. Gebruik het gereedschap Toverstaf om elke structuur van de interesse te markeren en druk op de letter T op het toetsenbord om de geselecteerde ROI toe te voegen aan het pop-up ROI Manager -venster. Herhaal dit proces voor elk segment (tijdsbestek) in de afbeeldingsstapel en sla alle ROIs op door op de knop meer te klikken en Opslaante selecteren. Open de gezipte ROI-map om de ROI Manager te laden en klik op elke ROI-id in het linker zijpaneel. Selecteer meten in het menu analyseren en herhaal deze opdracht voor elke ROI-id om de objecten van belang te kwantificeren in alle segmenten van de afbeeldingsstapel. Als het verschuiven van cellen geen probleem is en het brandvlak hetzelfde blijft voor alle segmenten van de stapel, klikt u op multi Measure in de ROI Manager. Selecteer in het pop-upvenster alle segmenten meten in plaats van één rij per segment om metingen over de afbeeldingsstapel te herhalen. Sla resultaten op als een CSV-bestand en analyseer metingen in een Statistiekprogramma. Voor meerdere nucleaire signalen met de structuur van belang, druk op de SHIFT -toets bij het selecteren van objecten met de tool toverstaf om een enkele ROI te maken. U ook een ROI van constante grootte maken met het gereedschap Ovaal om alle signalen van belang te omvatten.Opmerking: Deze ovale benadering kan nodig zijn om het signaal gedrag te meten en te beschrijven over een gebied waar het fluorescentie signaal in de loop van de tijd in grootte en intensiteit verandert. Signaalintensiteit, in dit geval, is de gemiddelde signaal dichtheid over een bepaald gebied. Kwalitatief bepalen van de co-lokalisatie van twee fluorescerende signalen door de verandering in de kleur van de signaal overlap regio. Echter, als de co-lokalisatie zone vernauwt, het is moeilijker om te onderscheiden van signaal overlapping. In dit geval volgt u de onderstaande stappen. Teken met het gereedschap kanalen, zoals beschreven in stap 5,6, een rechte lijn over elk signaal in kwestie en selecteer de opdracht Profiel plot in het menu analyseren. Herhaal deze stap voor alle kleuren in kwestie met dezelfde getekende lijn. In het plot van het pop-upvenster voorbeeld dat na elke profilerings stap wordt weergegeven, drukt u op de knop List om een venster met plot waarden op te roepen en slaat u de metingen voor elk signaal op als een CSV-bestand. Maak in een Statistiekprogramma een grafiek waarin de grijze waarde voor elk signaal wordt uitgezet ten opzichte van de corresponderende locatie (in μm) langs de getekende lijn. Gebrek aan overlap tussen signaal profiel plots duidt in het algemeen op het gebrek aan co-lokalisatie.Opmerking: Gebruik de tool plot profile op geprojecteerde afbeeldingen om de co-lokalisatie van het signaal te onderzoeken. Dit is alleen betrouwbaar als een dergelijke overlapping ook wordt waargenomen door de afbeelding z-stack. Gebruik het gereedschap multi Kymograph in het menu analyseren om het dynamische gedrag van fluorescerende eiwitten na verloop van tijd te bewaken. De resulterende afbeelding toont de fluorescerende signaal beweging door een reeks verkorte snapshots in elk segment van de z-stack, die individuele tijdpunten representeert. Gebruik het hulpprogramma kanalen zoals beschreven in stap 5,6 om het object van belang in het juiste kanaal te isoleren. Zorg ervoor dat het geselecteerde object of de structuur niet aanzienlijk verschuift door de z-stack. Plaats een rechte lijn of rechthoek over het object, selecteer het gereedschap multi Kymograph in het menu analyseren en voer de gewenste breedte in van de lijn die het object overlegt. Maak beeld panelen die nucleaire dynamiek over een bepaald tijdvenster laten zien met behulp van het gereedschap kanalen zoals beschreven in stap 5,6 en door de stapels te selecteren en montage hulpmiddelen te maken in het menu afbeelding. Voer in het pop-upvenster maken van de montage het gewenste aantal kolommen en rijen in, stel een schaal factor van 1,0 in, kies de eerste en laatste segmenten (tijdframes) en wijzig de randbreedte in ten minste 5 voordat u op OK drukt. Het is mogelijk om te kiezen welke afbeeldingen in de stapel moeten worden weergegeven door stappen te wijzigen die passen bij de gewenste volgorde. Als u een film wilt genereren, uploadt u de gewenste Hyper stack, selecteert u Opslaan als een AVI -bestand in het menu bestand , kiest u geen voor compressieen voert u een frame snelheid van 2-8 fps in. Selecteer de opdracht montage maken tijdens het verzamelen van samengestelde in het gereedschap kanalen om alle kleuren die de afbeelding omvatten samen te voegen of te scheiden.Opmerking: In dit protocol zijn twee AVI-bestanden (film 1-2) beschikbaar. Gebruik ze in Fiji om verschillende functies te proberen die in stap 5 zijn gemarkeerd. Als u één representatieve cel wilt weergeven, gebruikt u Transformeren en roteren in het menu afbeelding en voert u de rotatie graden in. Negatieve getallen roteren objecten naar links, terwijl positieve waarden objecten naar rechts roteren. Zodra de cel zich in de juiste richting bevindt, tekent u een rechthoek die de hele cel beslaat via de z-stack of tijdens de tijdsperioden en selecteer bijsnijden in het menu afbeelding . Ga verder zoals vermeld in stap 5,16 en 5.16.1 om een beeldpaneel of film te genereren. Voeg een schaalbalk toe aan het beeldpaneel of de film door extra en schaalbalk te selecteren in het menu analyseren. In de schaalbalk pop-upvenster, voer 5-15 voor breedte in micron voor afzonderlijke cellen of 100-250 voor hele velden van weergave, kies wit of zwart voor kleur, en kies een geschikte locatie voor het plaatsen van de schaalbalk. Voor films is het handig om tijd progressie te tonen tijdens nucleaire evenementen. Als u tijdwijziging tussen frames wilt weergeven, selecteert u afbeelding, klikt u op stapels, gebruikt u het gereedschap tijds stamper , geeft u het start frame in de tijdreeks aan en selecteert u een geschikte locatie voor de tijdweergave.