Examen de la dinámica nuclear de levadura de ficción mitotica y meiótica por microscopía de células vivas de fluorescencia

1. Preparación de medios15,16 Soluciones de stock Preparar una solución de 50x salina añadiendo 52,5 g de MgCl26H20, 0,735 g de CaCl22X20, 50 g de KCl y 2 g de Na2S04 en un frasco que contiene 1 L de agua destilada. Mezclar la solución a fondo y esterilizar por filtración. Colocar a 4 oC para un almacenamiento a largo plazo. Hacer una solución de 1.000x vitamina stock mezclando 1 g de ácido pantoténico, 10 g de ácido nicotínico, 10 g de inositol, y 10 mg de biotina en una botella que contiene 1 L de agua destilada. Mezclar bien la solución y esterilizar por filtración. Manténgase a 4 oC para un almacenamiento a largo plazo. Preparar una solución de stock mineral de 10.000x añadiendo 5 g de ácido bórico, 4 g de MnSO4, 4 g de ZnSO4x 7H2O, 2 g de FeCl26H2O, 1 g de KI, 0,4 g de ácido molibddico, 0,4 g de CuSO4x 5H20 , y 10 g de ácido cítrico en un frasco que contiene 1 L de agua destilada. Mezclar la solución a fondo y esterilizar por filtración. Colocar a 4 oC para un almacenamiento a largo plazo. Hacer soluciones individuales de stock de nutrientes mediante la adición de 7.5 g de adenina, leucina, histidina o lisina en una botella que contiene 1 L de agua destilada. Utilice sólo 3,75 g para hacer la solución de uracilo. Esterilice las soluciones mediante autoclave.NOTA: Con el tiempo, el uracilo se precipita fuera de la solución. Para volver a poner en la solución, calentar en el microondas a un 60% de potencia en incrementos de 10 s o colocar en un baño de agua de 55 oC durante 20 minutos. Gire la solución tibia hasta que desaparezcan todos los grumos de uracilo. Extracto de levadura más suplementos (Si) En un matraz de 2 L, añadir 1 L de agua destilada, 5 g de base de extracto de levadura, 30 g de glucosa, y 225 mg cada uno de adenina, uracilo, L-histidina, L-leucina, y L-lisina. Añadir 20 g de agar para hacer el medio sólido. Utilice una barra de agitación magnética para disolver completamente los ingredientes en la solución. El agar se derretirá después de que el medio se esteriliza por autoclave.NOTA: Para mayor comodidad, el polvo YES listo para usar también está disponible comercialmente. Medio mínimo de Edimburgo (EMM) y medio de glutamato pombe (PMG) En un matraz de 2 L, combine 1 L de agua destilada con 3 g de ftalato de hidrógeno potásicos, 2,2 g de Na2HPO4,5 g de NH4Cl, 20 g de glucosa, 20 ml de solución salada, 1 ml de solución de vitamina , y 0,1 ml de solución mineral. Reemplace NH4Cl por 2,2 g de sal monosódica de ácido L-glutámico para preparar La PMG. Para hacer el medio sólido, añadir 20 g de agar. Con una barra de agitación magnética, disuelva bien los ingredientes. El agar se derretirá después de que el medio se esteriliza por autoclave. Antes de su uso, agregue soluciones de caldo de nutrientes según sea necesario. Por cada 1 L de medio, añadir 15 ml cada uno de adenina, leucina, histidina, y lisina. Utilice 30 ml para el uracilo, ya que está menos concentrado que las otras soluciones nutritivas.NOTA: Para mayor comodidad, los polvos EMM y PMG listos para usar también están disponibles comercialmente. Extracto de malta (ME) Utilice un matraz de 2 L para mezclar 1 L de agua destilada con 30 g de extracto de malta y 225 mg cada uno de adenina, uracilo, histidina y leucina. Ajuste el pH a 5,5. Incluya 20 g de agar para hacer el medio sólido. Disolver componentes en la solución utilizando una barra de agitación magnética. El agar se derretirá después de que el medio se esteriliza por autoclave. Agar de esporulación con suplementos (SPAS) En un matraz de 2 L, añadir 1 L de agua destilada, 10 g de glucosa, 1 g de KH2PO4, 1 mL de acción de vitaminas, 45 mg cada uno de adenina, uracilo, histidina, leucina, e hidrocloruro de lisina. Añadir 20 g de agar para hacer el medio sólido. Utilice una barra de agitación magnética para combinar bien los ingredientes. El agar se derretirá después de que el medio se esteriliza por autoclave. 2. Cultura de la levadura de fisión15,16 Utilice el medio sólido YES para despertar las cepas de levadura de fission de la preservación criogénica. Dependiendo de los requisitos de temperatura de cada cepa, incubar a 25 oC o 32 oC durante 3-5 días. Cuando las colonias sean visibles, prepare un cultivo líquido de arranque. Recoger células de colonias individuales e inocularlas en tubos de ensayo que contengan un medio líquido DeS de 3 ml. Crecer a la temperatura adecuada hasta la fase de registro medio o tardío.NOTA: Para una aireación adecuada, utilice tubos o matraces con volúmenes al menos 5 veces mayores que el volumen de cultivo líquido previsto. Las velocidades de agitación entre 150-220 rpm son habituales para el crecimiento rutinario del cultivo. Dispensar 250-500 l de cultivo de arranque en un matraz de 50 ml que contiene 9,5-9,75 ml de YES, EMM o PMG más suplementos adecuados. Permita que las células crezcan a la densidad deseada y compruebe bajo el microscopio la morfología celular adecuada y el estado nutricional.NOTA: Para almacenar las cepas despertadas durante un mes, selle las placas YES con cinta adhesiva de parafina y colóquelas a 4oC. 3. Preparación de muestras2 Configuración de diapositivas de microscopio Añadir 2 g de agarosa en un vaso de precipitados de 500 ml que contenga 100 ml de suplementos mínimos medios más (mitosis) o SPAS líquidos (meiosis). Caliente la solución de agarosa en un horno microondas a un 60% de potencia en incrementos de 10 s o colóquela en un baño de agua de 55oC durante 10 minutos. Prepare la configuración de deslizamiento de agarosa (Figura1A)para asegurar una rápida preparación de la almohadilla y evitar que la agarosa fundida se solidifique prematuramente. Deje que la agarosa fundida se enfríe durante 1 min a temperatura ambiente y dispensar puntos de 50-100 ml en portaobjetos de microscopio utilizando puntas de pipeta de gran calibre. Antes de que la agarosa se enfríe, coloque una diapositiva del microscopio en la parte superior para generar una almohadilla de propagación de aproximadamente 1,5-2 cm de diámetro (Figura1B-C). El ancho de la almohadilla de agarosa es típicamente proporcional a la duración del tiempo de imagen. En otras palabras, las almohadillas más gruesas soportan períodos de diagnóstico por imágenes más largos. Utilice una mezcla de hidrocarburos como sellador para asegurar una cobertura adecuada de los portaobjetos con almohadillas gruesas de agarosa y para evitar la muerte celular por exposición a disolventes en los bordes de cobertura. Mezclar partes iguales (p/p) de vaselina, lanolina y parafina en un vaso de precipitados de 500 ml. Caliente los ingredientes en una placa caliente a 120 oC durante 5 min. A medida que los componentes se derriten, gire cuidadosamente la solución fundida para asegurar una mezcla adecuada. Configuración de muestra Para el examen de eventos mitóticos, cultivar células de cultivos iniciales en EMM líquido o PMG más suplementos a aproximadamente fase de registro medio (OD595 de 0.4). Centrifugar 1 ml de la suspensión celular a 1.375 x g durante 1 min, retirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en el medio mínimo más suplementos a un volumen final de 100 l. Para crear imágenes de eventos meióticos, crezca las células de los cultivos iniciales en el medio mínimo más suplementos a la fase de registro tardío (OD595 de 0.7-1.0). Combine volúmenes iguales de celdas de tipo de relación de posición opuestas (h- y h+) en una suspensión de celda de 1 ml. Células centrífugas a 1.375 x g durante 1 min y resuspender el pellet en ME líquido. Repita este paso tres veces para asegurar la eliminación eficiente de nutrientes. Después del último lavado ME, resuspenda las células en 1 ml de ME y agréguelas a un matraz de 50 ml que contenga 9 ml de ME. Incubar durante 12-16 h a 22-25 oC en una velocidad de rotación mínima (50-100 RPM). Abundante floculación celular, que resulta en muchos grumos redondos de levadura de festez e indica un apareamiento eficiente. Tomar 1 ml de muestra del cultivo de apareamiento y centrífuga a 1.375 x g durante 1 min. Eliminar el sobrenadante pero dejar 250 ml en el tubo para resuspender las células. Antes de colocar las células en las almohadillas de agarosa, el vórtice vigorosamente durante 5 s para interrumpir los grumos.NOTA: Los 250 ml de ME restantes utilizados para resuspender las células contienen factores de apareamiento que ayudan a las células a entrar en la meiosis. Coloque 20 s de una suspensión de células mitoticas o meióticas en una almohadilla de agarosa del 2%. Retire cualquier medio sobrante invirtiendo la diapositiva y poniéndola en la parte superior de una toalla de papel sin pelusas durante 2-3 s (Figura1D). Coloque el lado de la almohadilla deslizante hacia arriba y coloque suavemente un cubreobjetos de vidrio, asegurándose de no generar burbujas de aire (Figura1F).NOTA: Eliminar el exceso de medio con una toalla de papel es más eficiente en el tiempo que la absorción de gravedad, lo que es particularmente crítico en los experimentos de meiosis. Para crear una monocapa de celda, gire el encubierto en el sentido de las agujas del reloj con el dedo índice para uno (mitosis) o dos (meiosis) giros completos (Figura1F). Asegúrese de que la materia celular se dispersa a través de la almohadilla de agarosa permitiendo una mejor separación de células individuales o asci. Con la ayuda de un pequeño palo de madera, dispensar sellador fundido a lo largo de los bordes de la cubierta para sellar cada almohadilla de agarosa (Figura1G). Una vez que la almohadilla de agarosa esté sellada, colóquela en la etapa del microscopio y déjela equilibrar durante 10-15 minutos en las condiciones de imagen adecuadas (por ejemplo, temperatura) (Figura1H)para permitir que las burbujas de aire se disimulen y deje que se produzcan cambios de agarosa de última hora. Comience la toma de imágenes una vez que la diapositiva se equilibra de manera eficiente y no la elimine de la etapa hasta que finalice la recopilación de datos.NOTA: El control de la temperatura y la humedad está determinado por el sistema de microscopio empleado y los requisitos experimentales específicos. Si está presente, aplique el control de temperatura y humedad a todos los experimentos de imágenes. Si está ausente, los investigadores deben idear una manera de prevenir las fluctuaciones de temperatura, especialmente durante los experimentos de meiosis. 4. Imágenes de células vivas2 y procesamiento Utilice el objetivo 40x para encontrar los campos de visión adecuados para la imagen. Cambie al objetivo 60x para iniciar la adquisición de datos. Dependiendo del sistema de microscopio utilizado, el posterior reenfoque y seccionamiento de la muestra en cada momento se producirá manualmente o a través de un proceso automatizado por microscopio o software.NOTA: Las imágenes presentadas en este protocolo fueron recogidas utilizando un microscopio de deconvolución, fluorescencia equipado con conjuntos de filtros Sedat, RFP y GFP, etapa de nanomovimiento, lente objetivo 60x NA 1.4 y cámara CCD de 12 bits. Las persianas mecánicas incorporadas y las ruedas de filtro motorizadas permiten la exposición reducida a la excitación y el fotoblanqueo de las muestras. Utilice el software adecuado para adquirir y procesar imágenes. Para desconvenir imágenes, emplee las funciones de transferencia óptica proporcionadas por el fabricante.NOTA: Para obtener más información sobre el equipo y el software del microscopio utilizados en este protocolo, consulte la Tabla de materiales. Utilizar un microscopio de fluorescencia convencional para adquirir imágenes de células vivas asegurar que el microscopio recopile datos digitalmente, tenga objetivos 40x o 60x con aperturas numéricas (NA) superiores a 1.2, y sea capaz de realizar seccionamientos ópticos.NOTA: Sin estos requisitos, las imágenes mostrarán una resolución reducida, comprometiendo la calidad de las mediciones microscópicas y las observaciones cualitativas. Utilice programas plug-in gratuitos (por ejemplo, Fiji) para minimizar los errores de desenfoque sistemáticos derivados de la pérdida de contraste durante la adquisición de la imagen17,18,19,20 y para garantizar un análisis cuantitativo adecuado de la intensidad de la fluorescencia y de otros eventos temporales y dinámicos dentro de la célula.NOTA: Otros programas de desconvolución comercial disponibles se pueden encontrar en la Tabla de Materiales. Elija los conjuntos de filtros del microscopio que mejor coincidan con los fluoróforos bajo observación. Asegúrese de que los filtros de excitación y emisión tengan las pasadas de banda adecuadas que permitan la detección específica de proteínas fluorescentes. Por ejemplo, para detectar la señal CFP, es apropiado un paso de banda de excitación y emisión de 430/25 y 470/30, pero no para la fluorescencia RFP. Utilice un enfoque de configuración mínima efectiva (MESA) al tomar imágenes por imágenes de la levadura de fission en varios momentos. En otras palabras, evite el uso prolongado de longitudes de onda de excitación y emplee la menor potencia de excitación y el tiempo de exposición que generen datos de imagen aceptables, pero cuantificables y reproducibles. Para imágenes prolongadas durante la mitosis o la meiosis, limite el intervalo entre los puntos de tiempo de adquisición a 5-10 min. Aunque las almohadillas de agarosa del 2% pueden soportar sesiones de imágenes de 12 a 16 h, es probable que se desplace la célula debido a la evaporación de la agarosa. Por lo tanto, realizar experimentos completos de mitosis o meiosis en ventanas de 4-6 h o 8-10 h, respectivamente. Recopilar datos de imágenes para 4-8 h que consisten en al menos 24-48 puntos de tiempo de adquisición, respectivamente, una proteína de fluorescencia y una pila z por punto de tiempo y un canal fluorescente compuesto por 13 secciones con un espaciado de 0,5-m utilizando un objetivo de 60x. Esto requiere al menos 0,5-1 GB de espacio de almacenamiento en el disco duro. Así, además de eliminar el blanqueo de fotoblanqueos y el desplazamiento de celdas, crear un flujo de trabajo que considere las capacidades informáticas1,2,3.NOTA: Estos parámetros de adquisición se establecen y modifican normalmente en el software que controla las funciones del microscopio y que recopila y procesa imágenes. Para examinar los procesos nucleares específicos con más detalle, realice la adquisición de imágenes cada 5-10 s, siempre y cuando la emisión no disminuya sustancialmente después de la exposición frecuente. Realizar un análisis preliminar de la intensidad de la fluorescencia durante diferentes períodos de tiempo para determinar el punto después del cual la precisión de los datos recogidos ya no es fiable1,3. En el software de adquisición de imágenes y procesamiento de imágenes, utilice la proyección de intensidad máxima en las pilas z de la imagen para observar todas las estructuras con alta densidad de fluorescencia en un plano 2D independientemente de su ubicación vertical1,2, 3. Esto facilita un examen rápido de los procesos nucleares que se producen en diferentes vóxeles. Recopile una imagen de campo brillante de centro medio para generar una imagen de referencia de las celdas bajo observación. 5. ImageAnalysis20,21 NOTA: El análisis de imágenes en este protocolo se realiza utilizando Fiji. Para otros programas de análisis y complementos de Fiji, véase Tabla de materiales. Cargue una imagen desconvolved seleccionando la función Importador de bioformatos en el menú Plugins. En la ventana emergente Opciones de importación, seleccione Hyperstack, Modo de color predeterminadoy seleccione Escalado automático antes de pulsar el botón Aceptar. Asegúrese de que la ventana mostrada tenga el número correcto de canales de fluorescencia y marcos de tiempo desplazándose hacia los lados en las barras respectivas en la parte inferior. Guardar como un archivo Tiff, que no comprime los datos y evita la pérdida de información. Abra una imagen que contenga una barra de escala generada durante el procesamiento de datos por el software del microscopio. Determine la longitud de píxel de la barra de escala con la herramienta Línea recta para dibujar una línea paralela de tamaño similar y seleccione Medir en el menú Analizar. Agregue una barra de escala estableciendo la relación píxel a m de la imagen seleccionando Establecer escala en el menú Analizar. En la ventana emergente Establecer escala, introduzca la Distancia calculada en píxeles y la Distancia conocida en ám, establezca la relación de aspecto de píxeles en 1.0, coloque micrones como unidad de longitudy marque la casilla Global antes de hacer clic en el OK. Utilice la opción Definir medidas en el menú Analizar para elegir diferentes parámetros para cuantificar al seleccionar Medir. Para los fines de este protocolo, seleccione las siguientes métricas: Area, Perimeter, Mean gray value, Median, Min & max gray value, Integrated density, Stack positiony Display etiqueta. Dependiendo de la precisión de los datos recopilados, introduzca más de 1 para la opción Lugares decimales y marque la casilla Notación científica si es necesario. Después de aplicar el comando Medir, una ventana emergente Resultados mostrará los valores de cada parámetro pertinente. Guarde los resultados como un archivo .csv para su análisis futuro en un programa de estadísticas.NOTA: No es necesario separar una imagen en sus canales fluorescentes constituyentes para determinar la longitud, a menos que haya interferencia de señal entre los diferentes colores en cuyo caso siga el paso detallado a continuación. En caso de interferencia de señal, seleccione Color y La herramienta Canales en el menú Imagen y analice cada color por separado. Para medir la longitud de las estructuras no lineales, haga clic con el botón derecho en la herramienta Línea y utilice la opción Línea segmentada o Línea a mano alzada para trazar los objetos deseados. Para estructuras lineales o para determinar la distancia entre dos puntos, utilice la función Línea recta y seleccione Medir en el menú Analizar. Los valores de la longitud en el m se añadirán automáticamente a los parámetros previamente seleccionados en la opción Establecer medidas. Para medir los cambios en el tamaño de la señal yla intensidad de la fluorescencia, primero cree una biblioteca de región de interés (ROI), que aumenta la precisión de la cuantificación y facilita las mediciones rápidas a través de una pila de imágenes. Seleccione Color y la herramienta Canales en el menú Imagen. En la ventana emergente Canales, compruebe el canal de color para el que se medirá la intensidad o el área. Elija las funciones Ajustar y Umbral en el menú Imagen. Marque la casilla Fondo oscuro, seleccione el método Predeterminado (a menos que los datos recopilados requieran lo contrario) y seleccione Rojo para superponer las señales de interés.NOTA: La medición de la estabilidad, el movimiento y la localización de proteínas dependen estrechamente del umbral de color utilizado para crear bibliotecas de ROI. Es importante elegir el método de umbral correcto para el tipo de señal de marcador fluorescente que se visualizará17,18. Utilice la herramienta Varita para resaltar cada estructura de interés y pulse la letra T del teclado para agregar el ROI seleccionado a la ventana emergente del administrador de ROI. Repita este proceso para cada sector (marco de tiempo) en la pila de imágenes y almacene todos los ROI haciendo clic en el botón Más y seleccionando Guardar. Abra la carpeta de ROI comprimido para cargar el gestor de ROI y haga clic en cada identificador de ROI en el panel lateral izquierdo. Seleccione Medir en el menú Analizar y repita este comando en cada identificador de ROI para cuantificar los objetos de interés en todos los sectores de la pila de imágenes. Si el desplazamiento de celda no es un problema y el plano focal sigue siendo el mismo para todos los sectores de la pila, haga clic en Multi medida en el gestorde ROI. En la ventana emergente, seleccione Medir todos los sectores en lugar de Una fila por sector para iterar mediciones en toda la pila de imágenes. Guarde los resultados como un archivo csv y analice las mediciones en un programa de estadísticas. Para múltiples señales nucleares que comprenden la estructura de interés, presione la tecla Mayús mientras selecciona objetos con la herramienta Varita para crear un único ROI. Alternativamente, cree un ROI de tamaño constante con la herramienta Oval para abarcar todas las señales de interés.NOTA: Este enfoque ovalado puede ser necesario para medir y describir el comportamiento de la señal sobre un área donde la señal de fluorescencia cambia de tamaño e intensidad con el tiempo. La intensidad de la señal, en este caso, es la densidad media de la señal sobre un área determinada. Determinar cualitativamente la colocalización de dos señales fluorescentes por el cambio de color de la región de superposición de señal. Sin embargo, a medida que la zona de colocalización se estrecha, es más difícil distinguir la superposición de señal. En este caso, siga los pasos que se detallan a continuación. Usando la Herramienta Canales, como se describe en el paso 5.6, dibuje una línea recta sobre cada señal en cuestión y seleccione el comando Trazar perfil en el menú Analizar. Repita este paso para todos los colores en cuestión utilizando la misma línea dibujada. En la ventana emergente Gráfica de muestra que aparece después de cada paso de generación de perfiles, presione el botón Lista para llamar una ventana Valores de trazado y guarde las medidas para cada señal como un archivo csv. En un programa de estadísticas, cree un gráfico que trace el valor gris para cada señal con respecto a su ubicación correspondiente (en ám) a lo largo de la línea dibujada. La falta de superposición entre las gráficas de perfil de señal generalmente indica la falta de colocalización.NOTA: Utilice la herramienta Perfil de trazado en imágenes proyectadas para examinar la colocalización de señal. Esto sólo es confiable si tal superposición también se observa a través de la pila z de la imagen. Para supervisar el comportamiento dinámico de las proteínas fluorescentes a lo largo del tiempo, utilice la herramienta Multi Kymograph que se encuentra en el menú Analizar. La imagen resultante muestra el movimiento de la señal fluorescente a través de una serie de instantáneas condensadas en cada segmento de la pila z, que representa puntos de tiempo individuales. Utilice la herramienta Canales como se describe en el paso 5.6 para aislar el objeto de interés en el canal correcto. Asegúrese de que el objeto o estructura seleccionado no se desplaza considerablemente a través de la pila z. Coloque una línea recta o un rectángulo sobre el objeto, seleccione la herramienta Multi Kymograph en el menú Analizar e introduzca el ancho deseado de la línea que superpone el objeto. Cree paneles de imágenes que muestren dinámicas nucleares en una ventana de tiempo específica utilizando la Herramienta Canales como se describe en el paso 5.6 y seleccionando las herramientas Pilas y Crear montaje en el menú Imagen. En la ventana emergente Crear montaje, introduzca el número de columnas y filas deseadas, establezca un Factor de escala de 1.0, elija los sectores Primero y Último (marcos de tiempo) y cambie Ancho de borde a al menos 5 antes de pulsar OK. Es posible elegir qué imágenes de la pila mostrar cambiando Incrementos para adaptarse a la secuencia deseada. Para generar una película, cargue el hiperstack deseado, seleccione Guardar como archivo avi en el menú Archivo, elija ninguno para Compresióne introduzca una velocidad de fotogramas de 2-8 fps. Seleccione el comando Crear montaje mientras selecciona Compuesto en la herramienta Canales para fusionar o separar todos los colores que componen la imagen.NOTA: En este protocolo se proporcionan dos archivos avi (Movie 1-2). Utilícelos en Fiji para probar diferentes características resaltadas a lo largo del paso 5. Para mostrar una sola celda representativa, utilice Transformar y rotar en el menú Imagen e introduzca grados de rotación. Los números negativos giran los objetos a la izquierda, mientras que los valores positivos giran los objetos a la derecha. Una vez que la celda esté en la orientación adecuada, dibuje un rectángulo que abarque toda la celda a través de la pila z o durante los marcos de tiempo de interés y seleccione Recortar en el menú Imagen. Proceda como se menciona en los pasos 5.16 y 5.16.1 para generar un panel de imágenes o una película. Agregue una barra de escala al panel de imágenes o a la película seleccionando Herramientas y Escala en el menú Analizar. En la ventana emergente Barra de escala, escriba 5-15 para Ancho en micrones para celdas individuales o 100-250 para campos de vista completos, elija blanco o negro para Color y elija una ubicación adecuada para colocar la barra de escala. Para las películas, es útil mostrar la progresión del tiempo durante los eventos nucleares. Para mostrar el cambio de hora entre fotogramas, seleccione Imagen, haga clic en Pilas, utilice la herramienta Time Stamper, indique el fotograma de inicio en la serie temporal y seleccione una ubicación adecuada para la visualización de la hora.