荧光活细胞显微镜对微孔裂变酵母核动力学的检测
Summary
在这里,我们介绍活细胞成像,这是一种无毒显微镜方法,使研究人员能够研究在米氏体炎和美氏菌病期间活裂变酵母细胞中的蛋白质行为和核动力学。
Abstract
活细胞成像是一种显微镜技术,用于检查活细胞中的细胞和蛋白质动力学。这种成像方法没有毒性,一般不会干扰细胞生理学,并且需要最少的实验处理。低水平的技术干扰使研究人员能够研究细胞的多个周期的线粒,并观察从头到尾的美虫病。使用荧光标记,如绿色荧光蛋白 (GFP) 和红色荧光蛋白 (RFP),研究人员可以分析不同的因素,其功能对转录、DNA 复制、内聚和分离等过程非常重要。结合使用斐济(免费、优化的 ImageJ 版本)的数据分析,活细胞成像提供了评估蛋白质运动、定位、稳定性和定时以及核动力学和染色体分离的各种方法。然而,与其他显微镜方法一样,活细胞成像受光的内在特性的限制,在高放大倍率下限制了分辨率,并且对高波长的光漂白或光毒性也非常敏感频率。然而,通过一些谨慎,研究人员可以通过仔细选择正确的条件、菌株和荧光标记来绕过这些物理限制,以便适当可视化线粒体和中微事件。
Introduction
活细胞显微镜使研究人员能够在不杀死裂变酵母细胞的情况下检查核动力学,并消除对致命固定物和污渍的需求。除了膜和细胞骨骼外,还可以观察荧光标记蛋白的稳定性、运动、定位和时间,这些蛋白质涉及重要的事件,如染色体复制、重组和分离。运动。通过保持细胞活力和无毒信号检测,有最小的生理入侵。如果正确执行,这种显微镜方法可以减少因延长技术处理或杂散化学反应而产生的混淆效应。此外,在实验中,研究人员可以对裂变酵母的营养和应激状态、增殖效率和凋亡状态进行相关观察,以表明成像参数不当或细胞生理学异常1 ,2,3.
米氏症和美氏菌具有核和细胞分裂的特点。在美西斯,与线粒体相反,遗传含量减半,因为父细胞产生子细胞4。由于活细胞成像除了空间关系之外还提供时间维度,因此可以实时检查大量细胞。活细胞显微镜使研究人员能够利用荧光标记来研究核分裂的动态,其组蛋白5、合辛亚单位6、微管7、中心细胞8、基尼托利9、组分主轴杆体(SPB)10,和染色体乘客复合体(CPC)11。在染色体分离装置之外,活细胞成像也捕获了必要的蛋白质的行为,但不直接参与染色体分离。这些蛋白质的功能已被证明影响复制,染色体重组,核运动和染色体附着到微管12,13,14。这些观察有助于更好地了解细胞事件,其功能成分不适合生物化学或基因检查。随着显微镜技术的新进展,分辨率差、光漂白、光毒性和焦点稳定性等限制将会减少,从而有助于更好地实时观测线粒度和美微核动力学1。 2,3.梅氏菌是特别具有挑战性的,因为它是一个终端分化途径,需要密切关注时间。
该协议的目的是提出一种相对简单的方法来检查线突和美虫病中的实时裂变酵母核动力学。为此,必须使用未暴露于环境压力的细胞,制备能够承受长时间成像的甘蔗片,并在密度下安装细胞,以利于单细胞动力学的可视化。此外,该协议利用携带荧光标记蛋白质的细胞,作为核动力学(Hht1-mRFP或Hht1-GFP)、染色体分离(Sad1-DsRed)、细胞骨架动力学(Atb2-mRFP)、转录标记在 G1/S (Tos4-GFP) 中激活,并在梅氏菌(Rec8-GFP)中实现内聚稳定。该方法还引入了额外的核和细胞标记(表一),这些标记可用于不同的组合,以解决有关特定细胞过程的问题。此外,还介绍了基本的斐济工具,可帮助研究人员处理活细胞图像并分析不同类型的数据。这种方法的优势源于对蛋白质动力学、定时和稳定性的实时观察,来描述正确执行线虫和美虫病不可或缺的过程。
Protocol
1. 媒体准备15,16 库存解决方案 在含有 1 L 蒸馏水的瓶中加入 52.5 g MgCl2+6H20、0.735 g 的 CaCl2+2H20、50 g KCl 和 2 g Na2S04,制备 50x 盐库存溶液。彻底混合溶液,通过过滤进行消毒。置于4°C进行长期储存。 在含有1升蒸馏水的瓶子中混合1克泛酸、10克烟酸、10克肌醇和10毫克生物素,制作1000x维生素储存溶液。将溶液混合好,通过过滤进行消毒。保持4°C长期储存。 通过加入 5 克硼酸、4 克 MnSO 4、4 g ZnSO4+7H2O、2 g FeCl2+6H2O、1 g KI、0.4 g 的甘油酸、0.4 g 的 CuSO4+5H20,制备 10,000x 矿物库存溶液和10克柠檬酸在含有1升蒸馏水的瓶子中。彻底混合溶液,通过过滤进行消毒。置于4°C进行长期储存。 在含有1升蒸馏水的瓶子中加入7.5克腺苷、亮氨酸、分氨酸或莱氨酸,使个人营养成分溶液。仅使用 3.75 g 来制作 uracil 溶液。通过高压灭菌对溶液进行灭菌。注:随着时间的推移,乌拉西尔会沉淀出溶液。为了再次引入溶液,以10秒的增量在微波炉中加热,或在55°C水浴中放置20分钟。 酵母提取物加补充剂 (YES) 在2升烧瓶中,加入1升蒸馏水、5克酵母提取物碱、30克葡萄糖和225毫克,分别加入腺苷、尿素、L-异氨酸、L-亮氨酸和L-赖氨酸。加入20克琼脂,使固体介质。 使用磁性搅拌棒将原料完全溶解到溶液中。通过高压灭菌对介质进行灭菌后,Agar 会熔化。注:为方便起见,市售即用型 YES 粉末也可供使用。 爱丁堡最小介质 (EMM) 和谷氨酸介质 (PMG) 在 2 L 烧瓶中,将 1 L 蒸馏水与 3 克邻苯二甲酸钾、2.2 克 Na2HPO 4、5 g NH4Cl、20 g 葡萄糖、20 mL 盐库存溶液、1 mL 维生素库存溶液相结合,和0.1 mL的矿物库存溶液。用2.2克L-谷氨酸单钠盐替换NH4Cl,制备PMG。要制作固体介质,添加 20 克琼脂。 使用磁性搅拌棒,彻底溶解原料。通过高压灭菌对介质进行灭菌后,Agar 会熔化。使用前,根据需要添加营养素溶液。对于每1L的介质,加入15 mL每个阿丁,亮氨酸,血氨酸,和莱氨酸。使用30 mL的尿素,因为它比其他营养溶液的浓度要低。注:为方便起见,即用型 EMM 和 PMG 粉末也可用于商用。 麦芽提取物(ME) 使用 2 L 烧瓶将 1 L 蒸馏水与 30 克麦芽提取物和 225 mg 的腺苷、尿素、血氨酸和亮氨酸混合。将 pH 调整到 5.5。包括20克的琼脂,使固体介质。 使用磁搅拌棒将组件溶解到溶液中。通过高压灭菌对介质进行灭菌后,Agar 会熔化。 带补充剂的孢子琼脂 (SPAS) 在2L烧瓶中,加入1L蒸馏水、10克葡萄糖、1克KH2PO 4、1 mL维生素,45毫克,每瓶腺苷、尿素、异丙氨酸、亮氨酸和盐酸赖氨酸。加入20克琼脂,使固体介质。 使用磁性搅拌棒彻底组合原料。通过高压灭菌对介质进行灭菌后,Agar 会熔化。 2. 裂变酵母文化15,16 使用 YES 固体介质唤醒低温保存的裂变酵母菌株。根据每个菌株的温度要求,在25°C或32°C孵育3-5天。 当菌落可见时,准备启动液体培养。从单个菌落中挑选细胞,并将其接种到含有3 mL YES液体介质的试管中。在适当的温度下生长到中或晚日志阶段。注:为进行适当的曝气,请使用体积至少比预期液体培养体积大 5 倍的管或烧瓶。在 150-220 rpm 之间摇动速度是常规培养增长的惯例。 将 250-500 μL 的起动机培养剂放入 50 mL 烧瓶中,其中含有 9.5-9.75 mL 的 YES、EMM 或 PMG 以及适当的补充剂。允许细胞生长到所需的密度,并在显微镜下检查适当的细胞形态和营养状态。注:要将唤醒菌株储存长达一个月,用石蜡胶带密封 YES 板,并放置在 4°C。 3. 样品制备2 显微镜幻灯片设置 在含有100 mL的最小介质加补充剂(米毒)或液体SPAS(美毒)的500 mL烧杯中加入2克甘蔗。将角玫瑰溶液以60%的功率以10秒的增量加热,或在55°C水浴中放置10分钟。准备甘蔗糖制滑装置 (图 1A), 以确保快速垫准备,并防止熔融的甘蔗过早凝固. 在室温下,让熔融的甘蔗冷却1分钟,并使用宽孔移液器吸头在显微镜幻灯片上分配50-100μL点。在蔗甘蔗冷却之前,将显微镜幻灯片放在顶部,以产生直径约1.5-2厘米的铺垫(图1B-C)。角玫瑰垫的宽度通常与成像时间长度成正比。换句话说,较厚的焊盘可承受更长的成像周期。 使用碳氢化合物混合物作为密封剂,以确保用厚厚的甘蔗片正确覆盖滑片,并防止在盖玻片边缘暴露溶剂导致细胞死亡。将石油果冻、羊毛脂和石蜡的等份(w)混合在 500 mL 烧杯中。在 120°C 加热热盘上的成分 5 分钟。当部件熔化时,小心地旋转熔融溶液,以确保适当的混合。 示例设置 为了检查线粒事件,在液体EMM或PMG加补充中从起始培养物生长细胞,以近似于中日志阶段(OD595,即0.4)。在1,375 x g下将细胞悬浮液的离心1 mL,1分钟,去除上清液,并在最小介质中重新悬浮细胞颗粒,补充到100 μL的最终体积。 要成像中值事件,请从起始培养物中以最小介质加补量到晚日志阶段(OD595的 0.7-1.0)生长细胞。将相对配合型细胞(h-和 h=)的等量组合在1 mL细胞悬浮液中。1,375 x g的离心细胞 1 分钟,并将颗粒重新悬浮在液体 ME 中。重复此步骤三次,以确保有效的营养去除。 上次 ME 洗涤后,将细胞重新悬浮在 ME 的 1 mL 中,并将其添加到包含 9 mL ME 的 50 mL 烧瓶中。在 22-25 °C 下以最小转速(50-100 RPM)孵育 12-16 小时。丰富的细胞絮凝,导致许多圆形裂变酵母团块,并指示有效的交配。 以1,375 x g在1,375 x g下采集1mL的交配培养物样本,用1分钟消除上清液,但将250μL留在管中,以重新悬浮细胞。在将细胞放在甘草垫上之前,涡旋5s剧烈地破坏团块。注:用于重新悬浮细胞的剩余 250 μL ME 包含帮助细胞进入美氏菌的交配因子。 将20 μL的线粒或中值细胞悬浮液放在2%的甘蔗垫上。通过反转幻灯片并将其放在无绒纸巾的顶部 2-3 s(图 1D),去除任何多余的介质。将滑垫侧上,轻轻放置玻璃盖玻片,确保不产生气泡(图1F)。注:用纸巾消除多余的介质比重力吸收更省时,这在美氏症实验中尤为重要。 要创建细胞单层,请用食指顺时针旋转盖玻片,进行一个(米毒)或两个(梅氏症)全圈(图1F)。确保细胞物质分散在甘蔗垫上,从而更好地分离单个细胞或Asci。借助小木棍,沿盖玻片边缘分配熔融密封剂,以密封每个角糖垫(图1G)。 一旦腺糖垫被密封,将其放在显微镜阶段,让它在适当的成像条件(例如温度)(例如温度)(图1H)中平衡10-15分钟,让气泡消散,让任何最后一分钟的腺糖发生偏移。在幻灯片有效平衡后开始成像,在数据收集结束之前不要将其从舞台中删除。注:温度和湿度的控制由采用的显微镜系统和具体的实验要求决定。如果存在,请对所有成像实验应用温度和湿度控制。如果不存在,研究人员必须设计一种方法来防止温度波动,特别是在美氏症实验期间。 4. 活细胞成像2和处理 使用 40x 目标查找图像的相应视场。切换到 60x 目标以开始数据采集。根据所使用的显微镜系统,随后在每个时间点对样品进行重新聚焦和切片将手动或通过显微镜或软件自动化过程进行。注:该协议中提供的图像采用带Sedat、RFP和GFP滤光片的去卷积显微镜、RFP和GFP滤波器组、纳米运动级、60x NA 1.4物镜和12位CCD相机进行收集。内置机械百叶窗和电动滤光轮,可减少样品的激发暴露和光漂白。 使用适当的软件来获取和处理图像。要对图像进行分光,需要使用制造商提供的光学传输功能。注:有关本协议中使用的显微镜设备和软件的详细信息,请参阅材料表。 使用传统的荧光显微镜获取活细胞图像,确保显微镜以数字方式收集数据,具有 40 倍或 60 倍的物镜,数值孔径 (NA) 大于 1.2,并且能够执行光学切片。注:如果没有这些要求,图像将显示分辨率降低,从而影响微观测量和定性观测的质量。 使用免费插件程序(例如斐济),以尽量减少图像采集过程中因对比度损失而导致的系统模糊误差,并确保适当的定量分析荧光强度和细胞内其他时间和动态事件。注:其他可用的商业去卷积程序可在材料表中找到。 选择与观察中的荧光量最匹配的显微镜滤镜集。确保激发和发射过滤器具有正确的带路,允许对荧光蛋白进行特定检测。例如,要检测 CFP 信号,430/25 和 470/30 的激励和发射带传递是合适的,但不适用于 RFP 荧光。 在多个时间点成像裂变酵母时,请使用最低有效设置方法 (MESA)。换句话说,避免长时间使用激发波长,并采用最低的激发功率和暴露时间,从而产生可接受但可量化和可重现的成像数据。 对于在米毒或美氏症期间进行长时间成像,将采集时间点之间的间隔限制在 5-10 分钟。虽然2%的甘蔗垫可以承受12至16小时的成像过程,但由于Agarose蒸发,细胞转移是可能的。因此,分别在4-6小时或8-10小时窗口进行全线虫或美氏体实验。 收集 4-8 h 的成像数据,包括至少 24-48 采集时间点、分别为一个荧光蛋白、每个时间点 z 堆栈和荧光通道,每个时间点和荧光通道由 13 个部分组成,使用 60x 物镜,间距为 0.5 μm。这至少需要 0.5-1 GB 的硬盘存储空间。因此,除了消除光漂白和细胞转换外,创建一个考虑计算能力1、2、3的工作流。注:这些采集参数通常在控制显微镜功能的软件中设置和修改,该软件用于收集和处理图像。 为了更详细地检查特定的核过程,每5-10s执行一次图像采集,只要在频繁曝光后发射量没有大幅度降低。对不同时间段进行初步荧光强度分析,确定所采集数据的准确性不再可靠的1,3点。 在图像采集和图像处理软件中,使用图像 z 堆栈上的最大强度投影来观察 2D 平面上具有高荧光密度的所有结构,而不管其垂直位置1、2、 3.这有助于快速检查不同体素中发生的核过程。收集中焦亮场图像,生成被观察的细胞的参考图片。 5. 图像分析20,21 注:此协议中的图像分析使用斐济执行。有关其他分析程序和斐济插件,请参阅材料表。 通过在插件菜单下选择生物格式导入器功能,上传已发送的图像。在”导入选项”弹出窗口中,选择”超级堆栈””默认颜色模式”,然后选中”自动缩放”,然后再按下”确定”按钮。 通过在底部的相应条上侧向滚动,确保显示的窗口具有正确数量的荧光通道和时间范围。另存为 Tiff 文件,不会压缩数据并防止信息丢失。 打开包含显微镜软件数据处理过程中生成的比例条的图像。使用直线工具确定比例尺的像素长度,以绘制大小相似的平行线,然后从”分析”菜单中选择”度量”。通过从”分析”菜单中选择”设置比例”来设置图像像素与 μm 比率来添加比例栏。 在”设置比例”弹出窗口中,输入计算的距离(以像素为单位)和”已知距离”(以 μm为单位),将像素纵横比设置为 1.0,将微米设置为长度单位,然后选中”全局”框,然后单击”确定”按钮。 在选择”测量”菜单下使用”设置测量”选项选择不同的参数进行量化。 出于此协议的目的,选择以下指标:面积、周长、平均灰值、中位数、最小值和最大灰值、集成密度、堆栈位置和显示标签。 根据收集的数据的精度,为”十进制位”选项输入 1 以上,并在必要时选中”科学记数法”框。应用”测量”命令后,”结果”弹出窗口将显示每个相关参数的值。将结果另存为 .csv 文件,以供将来在统计程序中进行分析。注:不必将图像分离到其组成荧光通道中以确定长度,除非不同颜色之间存在信号干扰,在这种情况下,请遵循下面详述的步骤。 在信号干扰的情况下,从图像菜单中选择”颜色和通道工具”并分别分析每种颜色。要测量非线性结构的长度,请右键单击”线工具”并使用”分段线”或”手绘线”选项来跟踪所需的对象。 对于线性结构或确定两点之间的距离,请使用直线特征并从”分析”菜单中选择”测量”。以 μm 为单位的长度值将自动添加到以前在”设置测量”选项下选择的参数中。 为了测量信号大小和荧光强度的变化,首先创建一个感兴趣的区域 (ROI )库,这提高了量化精度,并有助于跨图像堆栈进行快速测量。在”图像”菜单下选择”颜色和通道工具”。 在”通道”弹出窗口中,检查将测量强度或区域的颜色通道。在”图像”菜单下选择”调整”和”阈值”功能。选中”暗背景”框,选择Default方法(除非收集的数据另有要求),然后选择红色来覆盖感兴趣的信号。注:蛋白质稳定性、运动和定位的测量与创建 ROI 库所用的颜色阈值密切相关。重要的是选择正确的阈值方法,为荧光标记信号的类型可视化17,18。 使用魔杖工具突出显示每个感兴趣的结构,然后按键盘上的字母T将所选 ROI 添加到弹出的 ROI 管理器窗口中。对图像堆栈中的每个切片(时间帧)重复此过程,并通过单击”更多”按钮并选择”保存”来存储所有ROI。 打开压缩ROI 文件夹以加载ROI管理器,然后单击左侧面板上的每个ROI标识符。从”分析”菜单中选择”度量”,并在每个 ROI 标识符上重复此命令,以量化图像堆栈所有切片中感兴趣的对象。 如果单元移动不是问题,并且堆栈的所有切片的焦点平面保持不变,请单击ROI 管理器中的多度量值。在弹出窗口中,选择”测量所有切片”,而不是每个切片一行,以遍放整个图像堆栈中的度量值。将结果保存为 csv 文件,并在统计程序中分析测量值。 对于包含感兴趣结构的多个核信号,在使用魔杖工具选择对象时按Shift键可创建单个 ROI。或者,使用Oval 工具创建恒定大小的 ROI,以包含所有感兴趣的信号。注:这种椭圆形方法可能是必要的,以测量和描述信号行为的区域,荧光信号的大小和强度随时间的变化。在这种情况下,信号强度是给定区域的平均信号密度。 通过信号重叠区域的颜色变化,定性地确定两个荧光信号的共同定位。但是,随着共定位区域的缩小,区分信号重叠变得更加困难。在这种情况下,请按照以下步骤操作。 使用步骤 5.6 中所述的通道工具,在每个有问题的信号上绘制一条直线,并在”分析”菜单下选择”绘图配置文件”命令。 对使用同一绘制线的所有颜色重复此步骤。 在每个分析步骤后出现的”示例弹出窗口”窗口中,按”列表”按钮可调用”绘图值”窗口,并将每个信号的测量值另存为 csv 文件。 在统计程序中,创建一个图形,根据绘制线的相应位置(以 μm 为单位)绘制每个信号的灰值。信号剖面图之间缺乏重叠通常表明缺乏共同定位。注:使用投影图像上的”绘图配置文件”工具检查信号共定位。仅当通过图像 z 堆栈观察到这种重叠时,这才可靠。 要监控荧光蛋白随时间的动态行为,请使用”分析”菜单下的多测光工具。生成的图像显示荧光信号通过 z 堆栈的每个切片中的一系列压缩快照(表示单个时间点)的荧光信号移动。 使用步骤 5.6 中描述的通道工具将目标对象隔离在正确的通道中。确保所选对象或结构不会在 z 堆栈中发生较大移动。在对象上放置一条直线或矩形,从”分析”菜单中选择”多Kymograph”工具,然后输入覆盖对象的直线的所需宽度。 创建图像面板,使用步骤 5.6 中所述的通道工具显示特定时间窗口上的核动力学,并从”图像”菜单中选择”堆栈”和”制作蒙太奇”工具。在”使蒙太奇”弹出窗口中,输入所需的列数和行数,将比例因子设置为 1.0,选择”第一个”和”最后一个切片”(时间帧),并在按”确定”之前将边框宽度更改为至少 5。可以通过更改增量以适合所需序列来选择要显示的堆栈中的图像。 要生成影片,请上传所需的超级堆栈,从”文件”菜单中选择”另存为avi文件”,为”压缩”选择”无”,然后输入 2-8 fps 的帧速率。在”通道工具”中选择”制作蒙太奇”命令,以合并或分离构成图像的所有颜色。注:此协议中提供了两个 avi 文件 (影片 1-2)。在斐济使用它们来尝试在步骤 5 中突出显示的不同功能。 要显示单个具有代表性的单元格,请使用”从图像”菜单变换和旋转,然后输入旋转程度。负数将对象向左旋转,而正值将对象向右旋转。一旦单元格处于正确的方向,绘制一个矩形,通过 z 堆栈或在感兴趣的时间范围内包含整个单元格,然后从”图像”菜单中选择”裁剪”。按照步骤 5.16 和 5.16.1 中所述继续生成图像面板或影片。 通过从”分析”菜单中选择”工具和缩放”栏,将比例条添加到图像面板或影片。在”比例尺”弹出窗口中,输入 5-15 表示单个单元格的宽度(以微米表示)或整个视场的 100-250,选择白色或黑色作为颜色,然后选择适当的位置来放置比例尺。 对于电影来说,在核活动期间显示时间进度是很有用的。要显示帧之间的时间变化,请选择”图像”,单击”堆栈”,使用”时间”篡改工具,指示时间序列中的开始帧,并为时间显示选择适当的位置。
Representative Results
无论活细胞成像是用于线虫病还是美氏菌病,在进行任何观察之前,使用健康的裂变酵母细胞都至关重要。生成数据的质量在很大程度上取决于起始材料。如果细胞因营养限制或过度生长而饿死,它们将显示过量的空穴和减小的细胞大小(饥饿,图2A)。对于线粒体实验,最好避免使用显示细胞压力的细胞(饥饿,图2A)。否则,实验结果将不一致且不可重复。为了规避这种限制,选择适当的野生类型控制,并熟悉感兴趣的突变体的各种表型。例如,饥饿12小时的线粒细胞停止主动复制DNA。由于 Tos4-GFP 表达与 G1/S 相活动22、23、携带此标记的对数细胞和一个用于核除法(Sad1-DsRed 10)的对数细胞(Sad1-DsRed10)显示泛核 Tos4-GFP 表达,Sad1-DsRed foci分离和正在进行的分离(建议活性DNA复制和细胞分裂)(日志,图2A),而饥饿的细胞显示没有这种活动(饥饿,图2A)。这一结果与裂变酵母中营养限制的作用一致,减少了G1中的转录,激活了G1/S细胞周期检查点,并促进了G0条目5。对于梅氏菌症实验,细胞必须生长到高密度,但没有达到固定阶段。之后,两种配偶类型的细胞混合在低氮介质中孵育。未能交配,如当细胞没有充分缺乏氮气时,将阻止它们进入美氏菌(低效,图2B)。交配细胞悬浮液的强棒絮凝作用可增加细胞与细胞的相互作用,从而表明成功交配和高效的美感诱导(效率,图2B)。 Agarose凝胶垫和细胞团块的物理破坏保证了单个细胞或asci的正确可视化(日志,图2A;高效,图 2B.垫必须提供一个刚性,但潮湿的平台,细胞同时固定到位,并防止干燥。此外,焊盘必须足够厚,以承受蒸发引起的变化,并提供一个水平表面,允许在整个图像采集过程中进行适当的聚焦(图1C)。盖玻片旋转是分离和分散交配聚合内的细胞所必需的(图1F;高效,图 2B.如果没有此步骤,很少asci,但许多单倍体细胞被观察到,因为asci成为被困在不可接近的交配团块层,而单倍体细胞可以自由地填充所有可用的单层斑点(图2B)。即使对于线粒体实验(其中细胞聚集问题较少),盖玻板旋转也会在焊盘周围移动细胞,以创建单个细胞层,在细胞之间有足够的空间,以减少挤塞效应并允许细胞复制(日志,图2A). Atb2是一种β-图布林成分,参与裂变酵母线粒体和美氏菌7、14的染色体分离。当荧光标记时,这种细胞骨架成分允许检查在线粒体中核分离的阶段。在前期(0′-20′,图3A),线轴的成核发生在主轴极体(SpBs)的核侧,如Atb2-mRFP纤维在Htt1-GFP5泛核背景上所揭示的那样。在元相-抗相过渡(20′-40′,图3A)期间,线心主轴向外延伸,原子核分裂成两个。当细胞进入端相(60′-80′,图3A)时,Atb2-mRFP以双向方向扩展,直到染色体完全分离。在此之后,Atb2-mRFP 纤维重新组合并扩散到细胞表面,以在每个产生的子细胞中恢复其相间形式。细胞因子(>120′,图3A)只发生在隔膜形成后,并通过裂变分裂细胞。在线粒周期中Hht1-GFP强度的变化揭示了核动力学中的三个重要步骤:元相-分析(中等强度,DNA压实:20′-40′,图3A-B),端相(低强度,DNA分离:60′-80′, 图3A-B)和G1(强度增加,DNA复制:100′-120′,图3A-B)。同样,但使用仅携带Hht1-mRFP的细胞,并在斐济使用多基图工具(见步骤5.15),可以观察从元相到端相的线粒分裂,并评估适当姐妹色度处理过程中涉及的核运动隔离(正常,图3C)。误分离的图形显示两个主要核路径之间的信号活动,表明由于染色体分裂或不适当的色谱分离可能造成的分离(滞后,图3C)。 如前所述,在萌芽和裂变酵母中,Tos4被转录在G1和在S阶段22,23的DNA复制期间的功能。这可以在Kymograph中观察到,在Sad1-DsRed10 foci移动到相反方向(指示核分裂)后,在细胞因子之前的隔膜形成(39′,图3D)后,Tos4-GFP表达在细胞内增加; 36′,图3E)。高 Tos4-GFP 活动的阶段从 M-G1/S 转换(45′,图 3E)的末尾开始,到 G2(>60′,图 3E)结束,正好在细胞分裂之后。虽然在G1期间大量扩散,Tos4-GFP信号强度增加后,Aa相和整个S相和共同本地化与隔离的Sad1-DsRed foci(45′-60′,图3E)。这一结果表明,当亚细胞(G1/S)的基因组复制已经开始时,裂变酵母的分裂期已经开始,但细胞因子尚未发生。 Hht1是裂变酵母中的组蛋白H3,通常用荧光标记进行修饰,以可视化核DNA5,14。在mitosis,当细胞从元相过渡到端相(20′-120′,图3A),观察到核质量的两个可区分的变化。第一个变化涉及在元相(20′,图3A)的核尺寸收缩,而第二个变化显示核在一相期间分裂(40′,图3A)。除了与线粒细胞共享这些变化外,在同源重组期间,美感细胞表现出核振荡(即尾声)(-100′ 至 -50′,图 4A-B),并在第二阶段 (70′-90′) 结束时进一步减小核大小,图 4A.Hht1-mRFP 用于检查错误分离的表型,如滞后或碎片染色体(滞后,图 3C)。它还用于观察和描述在美氏病的各个阶段的核动力学(图4A-B)。在大部分尾矿(HT:-100′ 到 -50′,图 4A-B)期间,核质量较大且大小波动。当细胞进入元相(MT:-40’至0′,图4A-B),核大小和振荡减小,与现阶段冷凝活性增加一致。第一阶段(MI:10′-60′,图4A-B)和II(MII:70′-90′,图4A-B)的开始与进一步的核削减和缺乏核运动有关,这与两个核分裂的特点密切相关梅氏I和II(MI和MII)。因此,当同源染色体对齐和重组时,与核大小波动有关,并且在两轮染色体分离后核尺寸减小。改变这些核动力学的等位可能与12、13年的基因组稳定性调节有关。 Rec8是裂变酵母中美感凝血辛的β-克列辛亚单位。它在DNA复制(mei-S)后加载到染色质上,并保持姐妹色质彼此连接,直到第二阶段。在元相I后,Rec8通过分离物从染色体臂上去除,并在中心受到Sgo1-PP2A的保护。在同源分离结束时,Rec8也消除在中心,从而允许姐妹染色分离(图5A)6,24。Rec8-GFP 与染色体分离标记(如 Sad1-DsRed 或 Hht1-mRFP)一起,允许在梅氏病期间实现内聚力动力学的可视化。Rec8-GFP 信号在 mei-S (<<-90',图 5A-B)、前期 I(-90′ 到 -50’、图 5A-B)和元相 I (-40′ 到 0’期间为泛核信号,图 5A-B)。这一观察揭示了Rec8-GFP沿着DNA复制后染色体轴的关联。当细胞进入一相(10′,图5A-B),Rec8-GFP强度在整个细胞核内降低,但在中心处保持强,在每个核质量(20′-70′,图5A-B)中形成焦点。这一结果与沿染色体手臂的Rec8-GFP降解一致,但在同源分离后产生的中心处则不一致。在二期之前,Rec8焦点消失,释放姐妹色质在MII(70′-80′,图5A-B)中分离。因此,Rec8-GFP 标记可用于检查破坏美感内聚的建立、去除和整体稳定性的条件。与核分裂标记(如 Hht1-mRFP5、13)配对,Rec8-GFP 可用于解决在美氏病之前和期间内聚时间及稳定性如何影响适当的染色体分离12 的问题 ,13.此方案不解决其动力学主要发生在细胞醇中的蛋白质。然而,表一显示了一些细胞蛋白,它们通常用于检查内分泌、外泄和细胞因子化等过程所需的细胞骨架和膜过程。 图1:制备用于活细胞成像的甘蔗片。(A) 使用移液器尖端支架、实验室胶带和显微镜幻灯片组装的滑动准备设置。放置彼此垂直的幻灯片可创建一个口袋,其中形成角玫瑰垫。在侧面添加实验室胶带片可调整角玫瑰垫的宽度,使之符合要求的规格。(B) 在将糖放在显微镜幻灯片上以制作垫子之前,让熔融的甘蔗冷却下来。在此步骤中,必须缓慢分配胶质体积,以避免产生气泡。(C) 顶部滑块被放置在分配的角胶点上,形成一个圆形垫,表面为直线,边缘均匀,没有明显的角胶裂纹。(D) 在将细胞悬浮液样本放在甘油垫上后,倒置滑动,放在无绒纸巾的上面,以去除多余的液体介质。(E) 小心地在Agarose垫上放置盖玻片,确保不捕获任何气泡,并检查焦点平面是否平坦,以避免细胞移动和对焦问题。(F) 缓慢而谨慎地旋转盖玻片顺时针,以扰乱细胞团块,并生成细胞单层,允许细胞扩张和更好的细胞可视化。(G,H)使用加热的碳氢化合物混合物密封角糖垫,并允许它们在成像前与所需温度平衡。请点击此处查看此图的较大版本。 图 2:选取正确的单元格。(A) 顶部面板显示裂变酵母细胞在 EMM 中留下饿死,加上 72 h 补充,底部面板显示正在对数生长的细胞。在留有饥饿的细胞中,小细胞形态可以被欣赏。红色开放箭头显示饥饿特征的真空颗粒。在对数培养物中,显示拉长形态和分体(红色箭头)的细胞比比皆是,表明有源的循环动力学。右侧面板显示在饥饿和增殖期间表达 Tos4-GFP 和 Sad1-DsRed 信号的细胞。泛核 Tos4-GFP 表达和 Sad1-DsRed 信号在活动增殖期间看到,但看不到局部到相反的细胞极,但不会在饥饿中出现。(B) 顶部面板显示同一配合类型 (h+) 的单元格未能有效地配合。红色开放箭头显示一对正在卡约奥米进行的真空细胞。这在h+细胞的培养中并不罕见,10%的细胞可以切换配偶型到h-。底部面板显示有效配合产生的片。Zygotic asci 采取多种形式,包括锯齿形(红色箭头)和香蕉单元格形状(红色开形箭头)。刻度条 = 5 μm 的长度。请点击此处查看此图的较大版本。 图3:三维核动力学。(A) 在一个mitosa细胞分裂周期(120分钟)中跟踪组蛋白H3(Hht1-GFP)和微管(Atb2-mRFP)蛋白质。Hht1-GFP 和 Atb2-mRFP 的单个信号以黑白面板显示,而 BF 合并以各自的颜色显示它们。(B) 在线粒周期内对 Ht1-mGFP 强度进行量化。Hht1水平的变化表明在G1的线粒体和DNA复制期间的核分裂。(C) 显示线粒体中正常或异常分离的图形,其中产生的核路径要么分叉并保留DNA完整性,要么分别偏离和促进染色体分裂或过早的染色体分离。(D,E)Kymograph 和显微图面板显示 M 到 G1/S 的持续时间,这些面板显示了 Sad1-DsRed 分离和核 Tos4-GFP 信号的外观。请注意,在斐济使用 FIRE LUT 生成的 E 中面板可创建强度分级热图,便于识别具有高 Tos4-GFP 表达式的点;在这种情况下,本地化到原子核和重叠的Sad1-DsRed信号,如预期的那样。刻度条 = 5 μm 的长度。请点击此处查看此图的较大版本。 图4:美的位核动力学。(A) 显示细胞核(Hht1-mRFP)的运动、压实和分裂(Hht1-mRFP)的面板系列。尾马 (HT) 显示了广泛的侧对侧核振荡,然后是元相 (MT),其中核横向运动减少,并在第一阶段之前完全停止。在美氏体I(MI)中,主要核质量分裂成两个,而在美氏体II(MII)中,在姐妹染色分离过程中产生四核。(B) 核区变化(Hht1-mRFP)在前期、元相、MI和MII中的量化。核区域在HT振荡期间是动态的,在MT中凝结,在MI和MII期间尺寸进一步减小,在那里很少观察到核运动(长核轴)。测量最长的核轴(长核轴)是基于这样一种理念,即当一个圆拉伸时,它不再有一个恒定的直径,并产生至少两个主轴:长轴和短轴。因此,在监测原子核的变化时,长轴或短轴的变化会指示核运动。刻度条 = 5 μm 的长度。请点击此处查看此图的较大版本。 图5:美的合辛动力学。(A) 显示 Rec8-GFP 信号变化如何与中值核动力学相关。在 HT 和 MT 期间,Rec8-GFP 信号是泛核的,并跟随核运动 (Hht1-mFRP)。在MI中,Rec8-GFP从细胞核中消散,只留下一对心塞,这与从染色体手臂中取出Rec8和在中心处建立Sgo1-PP2A保护一致。当细胞接近MII时,Rec8-GFP病灶开始消失,在二期之前不再被看见。(B) 从 HT 到 MII 的 Rec8-GFP 强度的量化。与A所示类似,GFP信号通过HT和MT高电平,在MI期间显著降低,在MI中完全消失。这种模式证实了染色体手臂和中心仪的合辛动力学,它保持姐妹的色谱系,直到准备在MII中分离。刻度条 = 5 μm 的长度。请点击此处查看此图的较大版本。 蛋白 功能 评论 标记 引用 赫特1 参与DNA包装的组蛋白H3 用于检查染色体动力学 赫特1-mRFP 5,14 托斯4 在 G1 阶段期间发生 Tos4 函数 受聘研究G1计时 Tos4-GFP 22,23 Rad21/ Rec8 复制后,参与保持姐妹色度在一起的共辛亚单位 用于分析线粒体 (Rad21) 和中位分离 (Rec8) 期间的内聚稳定性 Rad21-GFP/Rec8-GFP 6,24 Rad11 RPA 活动发生在线粒DNA修复、美形重组期间,并在元相中结束 研究线粒体中的DNA修复和美氏菌重组动力学 Rad11-YFP 5,13 拉德52 Rad52 的搭合性发生在线粒DNA修复和美感重组过程中 研究线粒体中的DNA修复和美氏菌重组动力学 Rad52-CFP 5,13 Cnp1 组蛋白 H3 CENP-A 专门在中心进行本地化 用于跟踪线虫和美氏菌的染色体分离动力学 Cnp1-mCherry 13 Swi6 HP1 同源蛋白参与异体素形成 受聘研究在中心和端粒处进行异异物素动员 Swi6-GFP 13 萨德1 Sad1 涉及将主轴杆体本地化到核信封 用于分析线虫和美虫病中的染色体分离 萨德1-mCherry 10 细胞和膜 Atb2 图布林α2参与微管细胞骨架组织 用于检查线粒体和美虫病的染色体分离 Atb2-mRFP 7,14 Ync13 参与囊泡介导运输的异细胞化和内分泌调控器 用于研究细胞因子期间细胞壁完整性 Ync13-mECitrine 25 拉尔克1 肌苷 II 子单元涉及收缩环收缩 用于探索隔膜成熟和收缩的动态 RIc1-mCherry 25 Ccr1 NADPH-细胞色素p450还原酶,是ER、等离子体和线粒体外膜的一部分 用于检查膜相关动力学,如内分泌、外泌和细胞因子 Ccr1N-GFP 5 格格1 细胞极性的建立与维持中涉及的红基核苷酸交换因子 用于检查全局微管依赖性细胞极性动力学 格格1-mCherry-GBP 26 福斯1 在细胞切除术期间参与行为因融合焦点组装的福林 用于研究与裂变酵母交配相关的融合动力学 福斯1-sfGFP 27 Mnn9 在Golgi仪器中参与蛋白质N相关糖基化的曼诺西尔西转移酶亚单位 研究货物在戈尔吉的成熟,因为它从cis-Golgi到跨戈尔吉 Mnn9-mCherry 28 Num1 马尾的皮质锚定因子 用于检查在中位前相 I 中核振荡期间线粒体依赖的 dynein 锚定 Num1-yEGFP 29 表1:核动力学和细胞动力学的标记。 影片 1:M 到 G1/S 过渡,显示主轴主体 (SPB;Sad1-DsRed) 在 Tos4-GFP 核信号的分离和累积之前分离。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。 电影2:完成线粒周期,显示微管(Atb2-mRFP)延伸与核(Hht1-GFP)分裂相关。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。
Discussion
在线虫和美西斯期间进行活细胞成像,在数据采集过程中,在不实质性干扰裂变酵母生理学的情况下,提供检查核动力学的机会。然而,必须谨慎行事,以确保细胞生长到所需的密度,没有环境压力;和梅氏菌病,细胞在终端分化期间成像,而不是太早或太晚。过度的细胞拥挤、饥饿和不适当的生长温度是导致不可重复观测的常见因素。此外,在应变结构期间,测试荧光标记是否干扰目标基因的功能或影响整体细胞健康至关重要。未能仔细检查携带荧光标记的菌株的表型可能会导致在相似基因型上产生不一致和无与伦比的结果。
虽然显微镜的甘蔗垫易于组装,但它们也可能在获取有价值的成像数据方面构成障碍。创建 Agarose 垫非常简单,只需将三张显微镜幻灯片彼此平行放置,在中间幻灯片上分配熔融的甘蔗,以及放置一个横向其他幻灯片顶部的幻灯片即可。然而,组装一种滑动机具设备是很有用的,它允许宽度修改,以制造耐抗、特定情况的角糖垫。提供垫宽度灵活性的简单滑动机包括平台(移液器吸头支架或工作台)、两个显微镜幻灯片和用作垫宽度调节机制的实验室胶带(图1A)。精确的焊盘厚度取决于成像时间要求、甘蔗品牌、温度、盖玻片密封剂、蒸发率等。因此,在数据采集前校准成像系统对于提高技术可重复性并提高活细胞成像1、2、3的质量非常重要。垫面、刚度和构图在长时间图像采集过程中至关重要。Agarose具有低背景荧光,易于成型,并在适当的浓度下,承受蒸发引起的结构变形。此外,将裂变酵母培养基与甘蔗素相结合不会损害图像质量,并允许对多个线粒体和美氏菌周期进行扩展观察。此外,避免任何气泡进行延时显微镜检查也非常重要。在Agarose垫内和样品内,气囊会随着时间的推移而膨胀,导致细胞移动并破坏焦点平面。如果细胞通过盖玻板旋转有效地分散,研究人员可以跟踪几代人的线粒过程以及从核聚变到孢子的中值事件。制作和选择适合成像实验的焊盘需要时间掌握,但一旦实现,将有助于高度信息性的显微镜观察。
与其他方法一样,活细胞显微镜并非没有技术限制。使用荧光标记的蛋白质为实验引入了边界,限制了可以研究的内容的范围。光漂白和光毒性是长时间采集图像的典型问题。它们可以通过不将细胞暴露在短波长下的时间过长或太频繁来抵消。对于涉及GFP、CFP、YFP、mRFP和DsRed的实验,在裂变酵母活细胞成像中使用的典型荧光蛋白,通常采用5-15%的激发光和100-500ms的暴露时间进行常规实验。然而,这些参数根据研究人员的具体实验要求而变化。此外,z-stack 由 9-13 节组成,使用 60x 物镜间距为 0.5 μm 间距,足以解决裂变酵母细胞的厚度。此外,确认荧光标记物不会破坏目标蛋白的正常调节或功能或产生虚假表型也很重要。因此,建议为同一目标基因构建包含不同荧光和亲和标记的菌株,以用不同方法证实观察结果。此外,研究人员有责任确保实验参数可以在实验中重现,并且收集的数据适合下游分析1,3。任何技术都无法取代经过时间考验的严格验证实验系统的做法,通过仔细观察和严格审查荧光信号的线性度。
最后,以不修改原始图像的格式分析显微镜数据至关重要。斐济提供了出色的文档工具来跟踪原始数据测量,并允许研究人员在一个会话中检查不同的单元参数。这些功能,以及丰富的在线教程和广泛的文献报道,使斐济成为测量、分析和呈现活细胞成像数据的重要工具,这些数据描述了裂变酵母在米氏体和美氏症中的核动力学。
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者们感谢娜塔莉亚·拉·福尔卡德和蒙·拉费尔特为本手稿的编写工作做了一个更愉快的努力。感谢福斯堡实验室的成员,他们凭借自己的洞察力、实验想法和道义支持为完成这项工作做出了贡献。该项目由NIGMS R35 GM118109向SLF支持。
Materials
| 60x Plan Apochromat objective lens | Olympus | AMEP4694 | |
| Adenine | Sigma | A-8751 | |
| Agar | 7558B | IB4917-10 kg | |
| Agarose | Sigma | A9539-500g | |
| Belly Dancer rotator | Stovall | US Patent #4.702.610 | |
| Biotin | Sigma | B-4501 | |
| Boric acid | Sigma | B-6768-5kg | |
| CaCl2·2H20, | Sigma | C3306-500G | |
| Citric acid | Sigma | C-0759 | |
| Convolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| CoolSnap HQ CCD camera | Roper | n/a | |
| Cover slip | VWR | 16004-302 | |
| CuSO4·5H20, | END | CX-2185-1 | |
| DeltaVision deconvolution fluorescence microscope | GE Healthcare/Applied Precision | n/a | |
| Diffraction PSF 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen | Sunrise | 2023;1kg | |
| FeCl2·6H2O | END | FX9259-04 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Heat plate | Barnstead | Thermo Lyne | |
| Histidine | Sigma | H8125-100g | |
| Huygens deconvolution software | SVI | n/a | |
| Imaris deconvolution software | Bitplane | n/a | |
| Incubator | Shell lab | #3015 | |
| Inositol | Sigma | I-5125 | |
| Iterative Deconvolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
| KCl | Mallinckvadt | 6858-04 | |
| Lanolin | Sigma | L7387-1kg | |
| Leucine | Sigma | L8912-100g | |
| Lysine | Sigma | L5626-500g | |
| Malt extract (ME) | MP | 4103-032 | |
| MgCl2·6H20 | AMRESCO | 0288-500G | |
| MetaMorph | Molecular Devices | n/a | |
| Microscope slides | VWR | 16004-422 | |
| MnSO4, | Mallinckvadt | 6192-02 | |
| Molybdic acid | Sigma | M-0878 | |
| Na2S04 | Mallinckvadt | 8024-03 | |
| Nicotinic acid, | Sigma | N-4126 | |
| Pantothenic acid | Sigma | P-5161 | |
| Paraffin wax | Fisher | s80119WX | |
| Pombe glutamate medium (PMG) | Sunrise | 2060-250 | |
| softWorx v3.3 image processing software | GE Healthcare | n/a | |
| Sporulation Medium powder | Sunrise | 1821-500 | |
| Temperature controlled centrifuge | Beckman | Allwgra 6KR xentrifuge | |
| Uracil | AMRESCO | 0847-500g | |
| Vaseline | Equaline | F79658 | |
| yeast extract | EMD | 1.03753.0500 | |
| Yeast extract plus supplements (YES) | Sunrise | 2011-1kg | |
| ZnSO4·7H2O | J.T.Baker | 4382-04 |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Escorcia, W., Shen, K., Yuan, J., Forsburg, S. L. Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy. J. Vis. Exp. (148), e59822, doi:10.3791/59822 (2019).